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皖儀科技離子色譜測(cè)定硫酸新霉素的含量

引言

硫酸新霉素是1949年從新霉素鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中分離得到的混合物，含有A、B、C3個(gè)成分，其中新霉素B和C為主要成分，新霉素A僅微量。硫酸新霉素主要通過與細(xì)菌、核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的效果。然而新霉素全身用藥有顯著腎毒性和耳毒性，故僅限于口服或局部應(yīng)用。因此主要用于治療皮膚感染性疾病，新霉素口服極少吸收（大約在5％），在腸道內(nèi)濃度很高，與其他抗生素混合口服可用于對(duì)腸道微生物群系的控制，適合于手術(shù)前的腸道消毒等。

硫酸新霉素目前中國(guó)藥典中使用的是抗生素微生物檢定法，該方法時(shí)間較長(zhǎng)，無法滿足大規(guī)模測(cè)試的需求，而在實(shí)際應(yīng)用過程中，客戶需要對(duì)不同時(shí)段發(fā)酵液，提取液，成品等進(jìn)行測(cè)試，以判斷工藝及方法是否符合要求。然而中國(guó)藥典中的方法的時(shí)效性和局限性無法滿足這一要求。

目前歐洲藥典主要采用離子色譜安培檢測(cè)法測(cè)試硫酸新霉素有效成分，而我國(guó)離子色譜法并未納入到中國(guó)藥典檢測(cè)方法中，基于此，皖儀科技開發(fā)了一種離子色譜測(cè)試方法檢測(cè)硫酸新霉素有效成分含量，樣品前處理操作簡(jiǎn)單，測(cè)試準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，不同組分間分離度良好，并且20分鐘可以完成一次檢測(cè)，可以滿足客戶大規(guī)模測(cè)試的要求，并且提高時(shí)效性，測(cè)試結(jié)果一致性，減少人為及系統(tǒng)誤差。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1測(cè)試條件

儀器：IC6600系列離子色譜儀配置安培檢測(cè)器，柱后衍生；

色譜柱：氨基糖苷類專用色譜柱（4.6 mm×150mm）；

保護(hù)柱：氨基糖苷類專用保護(hù)柱（30 mm×4 mm）；

柱溫：35℃；

流速：主泵1.0ml/min；副泵0.5ml/min

進(jìn)樣量：25μL；

檢測(cè)器：安培檢測(cè)器

1.2 使用試劑

淋洗液：量取20mL三氟乙酸和6mL濃度為500g/L的氫氧化鈉使用純水定容至1L容量瓶中，超聲，抽濾。

柱后堿液：量取40mL濃度為500g/L氫氧化鈉使用純水定容至1L,超聲，抽濾。

標(biāo)樣：硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品樣品：硫酸新霉素成品樣品，硫酸新霉素發(fā)酵液樣品注：

l  建議使用色譜級(jí)試劑，若是試劑純度不夠會(huì)使基線不平穩(wěn)，使得部分雜質(zhì)無法檢出。

l  對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)試時(shí)，因發(fā)酵液中含雜質(zhì)較多，需要進(jìn)行適當(dāng)稀釋，若是濃度過高會(huì)使待測(cè)樣品中雜質(zhì)含量過高，超出柱容量影響測(cè)試結(jié)果并且會(huì)損害色譜柱。

l  發(fā)酵液中因雜質(zhì)較多需要進(jìn)行前處理：離心，過濾等，以去除部分雜質(zhì)以達(dá)到最佳的檢測(cè)效果。若不進(jìn)行前處理可能會(huì)對(duì)色譜柱造成堵塞，損害色譜柱壽命等情況。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)效價(jià)用純水稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品硫酸新霉素效價(jià)分別為：10ug/mg，20ug/mg，40ug/mg，60ug/mg，80ug/mg，100ug/mg定容至100mL容量瓶中，即得。 

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列曲線濃度梯度表

2 測(cè)試結(jié)果

2.1 硫酸新霉素線性測(cè)試結(jié)果

依次移取10ug/mg、20ug/mg、40ug/mg、60ug/mg、80ug/mg、100ug/mg的系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按照1.1工作測(cè)試條件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線譜圖多點(diǎn)重疊圖如圖1，硫酸新霉素在該色譜條件下線性相關(guān)系數(shù)R=0.9999，線性良好。

     圖1 硫酸新霉素梯度效價(jià)色譜圖表2 線性方程

2.2 硫酸新霉素樣品圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖

在1.1的工作測(cè)試條件下條件下，對(duì)經(jīng)過前處理的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品樣品圖譜如圖2，成品樣品如圖3，發(fā)酵液樣品如圖4所示，可見無論是標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品圖譜中的目標(biāo)硫酸新霉素C、硫酸新霉素B離子峰形對(duì)稱，分離度良好，最終得到樣品中硫酸新霉素B、硫酸新霉素C的含量。

            圖2 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試譜圖

            圖3 成品樣品測(cè)試譜圖

           圖4 發(fā)酵液樣品測(cè)試譜圖

2.3 硫酸新霉素重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

硫酸新霉素效價(jià)100ug/mg標(biāo)連續(xù)6針重復(fù)圖譜重疊圖如下：測(cè)試結(jié)果：保留時(shí)間的RSD為0.051％~0.063％，峰面積保留時(shí)間RSD為0.223％，重復(fù)性良好，測(cè)試較為穩(wěn)定。

       圖5 重復(fù)性測(cè)試譜圖表3 重復(fù)性數(shù)據(jù)表

3 總結(jié)

本次采用皖儀科技離子色譜儀IC6600系列對(duì)硫酸新霉素樣品進(jìn)行系統(tǒng)適用性、標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證、重復(fù)性驗(yàn)證。測(cè)試結(jié)果峰形較好，線性良好，重復(fù)性滿足要求，靈敏度高完全滿足測(cè)試要求。