會(huì)員.png)
4
當(dāng)前位置：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司>>技術(shù)文章>>安捷倫惰性材料齊上陣，加碼 Native SEC-MS 分析
安捷倫惰性材料齊上陣，加碼 Native SEC-MS 分析
重組蛋白質(zhì)治療藥物（例如單克隆抗體 (mAbs)）的體積排阻色譜法 (SEC) 是檢測(cè)是否存在可能對(duì)安全性和有效性產(chǎn)生不利影響的大小異構(gòu)體的重要分析工具。SEC 通常使用非揮發(fā)性磷酸鹽緩沖液，這使得分離過(guò)程與質(zhì)譜 (MS) 不兼容。因此，峰鑒定需要進(jìn)行脫鹽（在線或離線）。實(shí)驗(yàn)已證明，由于非特異性相互作用，當(dāng)應(yīng)用于經(jīng)典的不銹鋼儀器/色譜柱配置時(shí)，與 MS 兼容的揮發(fā)性緩沖液（如乙酸銨）的分離度明顯低于磷酸鹽緩沖液。這些非特異性相互作用可通過(guò)使用生物惰性或生物兼容性流路來(lái)抵消。安捷倫應(yīng)用工程師近期工作顯示帶PEEK內(nèi)襯的 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱與 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)組合非常適合用于蛋白治療藥物的非變性 SEC/MS 分析。
為評(píng)估 SEC 流路中是否存在不銹鋼組件的影響，采用幾種系統(tǒng)或色譜柱組合對(duì) mAb 樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示磷酸鈉在所有測(cè)試組合中均提供了令人滿意的分離性能，HMW 物質(zhì)的回收率良好。當(dāng)用乙酸銨代替磷酸鈉并降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度時(shí)，在流路中存在不銹鋼組件的情況下，分離效果會(huì)受到不利影響。色譜柱硬件的影響使得不銹鋼色譜柱與作為流動(dòng)相的乙酸銨配合使用時(shí)，幾乎無(wú)法檢出 HMW 物質(zhì)（如有）。當(dāng)安裝帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱并使用 100 mM 乙酸銨運(yùn)行時(shí)，HMW 物質(zhì)重新出現(xiàn)。使用 50 mM 乙酸銨流動(dòng)相（在 MS 靈敏度方面最有利）時(shí)，只有生物兼容性液相色譜系統(tǒng)與帶 PEEK 內(nèi)襯的色譜柱的組合（右下色譜圖）能夠檢出 HMW 雜質(zhì)，提供有用的結(jié)果。
圖 2. 使用不同流動(dòng)相組成和不同惰性程度的硬件得到的曲妥珠單抗的 UV 280 nm SEC 色譜圖
圖 4 進(jìn)一步示出儀器對(duì)峰寬和拖尾的影響。當(dāng)應(yīng)用 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)時(shí)，峰寬始終較小。將磷酸鹽流動(dòng)相替換為與 MS 兼容的乙酸鹽后，峰拖尾也不會(huì)增加。另一方面，當(dāng)不銹鋼液相色譜系統(tǒng)上的流動(dòng)相改變時(shí)，峰寬和拖尾都會(huì)受到嚴(yán)重影響。降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度會(huì)放大這種效應(yīng)。
圖 4. 在使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng) (SST LC) 和 Agilent 1290 Infinity II 生物惰性液相色譜系統(tǒng)以及不同的流動(dòng)相組成獲得的曲妥珠單抗和 NISTmAb 的 UV 280 nm SEC 色譜圖中觀察到的峰寬和拖尾
1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)與帶 PEEK 內(nèi)襯的 AdvanceBio SEC 色譜柱（使用乙酸銨）相結(jié)合的出色性能，為搭配Agilent 6545XT Q-TOF 直接進(jìn)行非變性 MS表征提供了可行性。為平衡色譜性能與 MS 靈敏度，選擇 100 mM 乙酸銨流動(dòng)相。
圖 6 顯示了維布妥昔單抗（一種半胱氨酸偶聯(lián)的 ADC）的 SEC/UV/MS 分析結(jié)果。由于輕鏈和重鏈僅由非共價(jià)相互作用維持，因此如果使用傳統(tǒng)的反相變性條件進(jìn)行質(zhì)譜表征是很難獲得完整蛋白水平數(shù)據(jù)。使用Native SEC-MS進(jìn)行表征，解卷積的譜圖顯示了藥物分布和藥物/抗體比率 (DAR)，以及主要的糖型信息。
圖 6. ADC 維布妥昔單抗的 SEC/UV/MS。(A) UV 280 nm 色譜圖，以及 (B) 與單體峰相關(guān)的解卷積非變性質(zhì)譜圖，顯示藥物分布為 0 到 8 且 DAR 為 4
結(jié)論
當(dāng)使用非變性 SEC/MS 分析 蛋白治療藥物時(shí)，不能低估液相色譜儀器和色譜柱惰性的重要性。減少與流路中不銹鋼組件的非特異性相互作用，對(duì)于確保獲得足夠的色譜性能和 HMW 物質(zhì)的回收率至關(guān)重要。配備有 PEEK 內(nèi)襯的 Agilent AdvanceBio SEC 色譜柱在 Agilent Infinity II 生物液相與6545XT Q-TOF系統(tǒng)上，能夠?qū)崿F(xiàn)出色的非變性 MS 檢測(cè)。
“碼”上領(lǐng)取
即可免費(fèi)下載安捷倫采用完全生物兼容性流路對(duì) mAbs 進(jìn)行非變性 SEC/MS 分析應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)。
