材料與方法

實驗設(shè)計：本研究使用雌性BALB/c小鼠作為實驗?zāi)Ｐ?，通過肌肉注射給予LNP、LNP-mRNA或生理鹽水作為對照。在注射后不同時間點（2小時、16小時和40小時）收集注射部位肌肉組織，進行單細胞RNA測序分析。

單細胞RNA測序：使用10x Genomics平臺進行單細胞RNA測序，構(gòu)建注射部位肌肉組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。通過差異基因表達分析、主成分分析（PCA）和細胞間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等方法，系統(tǒng)解析mRNA疫苗在注射部位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

功能驗證：通過ELISA、IFN-γ ELISpot和流式細胞術(shù)等方法，驗證IFN-β在mRNA疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答中的作用。

實驗結(jié)果

2.1 注射部位免疫反應(yīng)的主要軸：

通過主成分分析（PCA），我們對mRNA疫苗在注射部位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)進行了系統(tǒng)性解析。結(jié)果顯示，這些免疫反應(yīng)主要分為兩個軸：

• PC1軸：代表由脂質(zhì)納米顆粒（LNP）成分驅(qū)動的基質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)。這一軸的反應(yīng)在空LNP（不含mRNA成分的LNP）和LNP-mRNA注射后均顯著增強，表明LNP本身具有強大的佐劑效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)基質(zhì)細胞（如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和壁細胞）產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

• PC2軸：代表由mRNA成分驅(qū)動的樹突狀細胞（DCs）I型干擾素（IFN）反應(yīng)。這一軸的反應(yīng)特異性地出現(xiàn)在LNP-mRNA注射后，而在空LNP注射后未觀察到顯著變化。這表明mRNA成分在注射部位能夠特異性地誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生I型IFN反應(yīng)。

2.2 mRNA在注射部位成纖維細胞中的富集：

通過單細胞RNA測序分析，我們詳細剖析了mRNA疫苗在注射部位各細胞類型中的分布情況。結(jié)果顯示，mRNA疫苗中的mRNA在注射部位成纖維細胞中高度富集。特別是在注射后16小時，成纖維細胞中的mRNA含量顯著高于其他細胞類型。

進一步的分析還表明，成纖維細胞在注射mRNA疫苗后表達IFN-β基因（Ifnb1），且這種表達特異性地由mRNA成分誘導(dǎo)?？誏NP注射后的成纖維細胞中未檢測到Ifnb1的表達，進一步證實了mRNA成分在誘導(dǎo)IFN-β表達中的特異性作用。

2.3 IFN-β在細胞免疫應(yīng)答中的作用：

為了驗證IFN-β在mRNA疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答中的作用，我們進行了一系列功能驗證實驗。首先，我們通過ELISA檢測了注射部位肌肉組織和血清中的IFN-β水平，發(fā)現(xiàn)LNP-mRNA注射后IFN-β水平顯著升高，而空LNP注射后則未觀察到顯著變化。

接下來，我們通過IFN-γ ELISpot實驗評估了不同免疫策略下小鼠的抗原特異性細胞免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示，在LNP+亞單位疫苗免疫策略中，共注射IFN-β顯著增強了抗原特異性細胞免疫應(yīng)答。相反，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，由于內(nèi)源性IFN-β的產(chǎn)生已經(jīng)達到飽和水平，共注射IFN-β并未進一步增強細胞免疫應(yīng)答。

為了進一步驗證IFN-β在細胞免疫應(yīng)答中的作用，我們還使用了IFN-β中和抗體進行阻斷實驗。結(jié)果顯示，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，注射部位IFN-β信號的阻斷顯著降低了抗原特異性CD8+ T細胞應(yīng)答。這些結(jié)果共同表明，注射部位的IFN-β在mRNA疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

除了上述發(fā)現(xiàn)外，我們還對注射部位成纖維細胞的動態(tài)變化進行了深入分析。通過軌跡分析，我們發(fā)現(xiàn)空LNP注射后，成纖維細胞群體發(fā)生了顯著變化，出現(xiàn)了Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19兩種炎癥性成纖維細胞亞群。這些亞群高表達多種趨化因子基因，能夠招募免疫細胞到注射部位。

進一步的分析還表明，F(xiàn)ib_Cxcl5和Fib_Ccl19亞群的出現(xiàn)依賴于LNP成分，而mRNA成分則主要誘導(dǎo)成纖維細胞表達IFN-β基因。這些發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)了LNP和mRNA作為mRNA疫苗兩大組分在誘導(dǎo)注射部位免疫反應(yīng)中的不同作用。

2.5.1 DC的IFN-β響應(yīng)：

為了追蹤mDC_ISGs的命運，我們還對dLNs進行了單細胞RNA測序分析。結(jié)果顯示，mDC_ISGs細胞群也存在于dLNs中，并且同樣高表達IFN響應(yīng)特征。這表明mDC_ISGs細胞不僅在注射部位產(chǎn)生，還能夠遷移到dLNs，可能在適應(yīng)性細胞免疫應(yīng)答的起源中發(fā)揮作用。

2.5.3 IFN-β對DCs功能的影響：

討論

本研究創(chuàng)新性的系統(tǒng)解析了mRNA疫苗在注射部位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，并揭示了IFN-β在促進細胞免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)，mRNA疫苗中的mRNA成分特異性地在注射部位成纖維細胞中誘導(dǎo)IFN-β表達，進而激活DCs的I型IFN反應(yīng)，最終促進抗原特異性細胞免疫應(yīng)答。

此外，本研究還強調(diào)了LNP和mRNA作為mRNA疫苗兩大組分的不同免疫佐劑效應(yīng)。LNP成分主要通過誘導(dǎo)基質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮佐劑作用，而mRNA成分則通過誘導(dǎo)IFN-β表達促進細胞免疫應(yīng)答。這一發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化mRNA疫苗設(shè)計提供了新的思路。

本研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，深入探討了mRNA疫苗在注射部位的早期免疫反應(yīng)，特別是IFN-β在促進細胞免疫應(yīng)答中的作用。我們的研究不僅增進了對mRNA疫苗免疫機制的理解，還為開發(fā)更高效、更安全的mRNA疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：Kim, Seongryong, et al. "Innate immune responses against mRNA vaccine promote cellular immunity through IFN-β at the injection site." Nature Communications 15.1 (2024): 7226.