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一、簡介：

  在進行微生物試驗時，菌種的挑選特別重要。除了要選對菌種外，還要注意對菌體生長狀態(tài)的把握。

  通常來說很多標準中都對試驗用菌有要求，有的會明確要求用培養(yǎng)多長時間的菌進行后續(xù)試驗，食品檢驗標準中經(jīng)常可以看到這類描述，如“挑取單個典型黑色菌落接種到FTG培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，用于后續(xù)的確證試驗。"“取生長旺盛的FTG培養(yǎng)液1 mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基……"（參考GB4789.13  食品微生物學檢驗  產氣莢膜梭菌檢驗），而有些標準則不厭其煩地強調“新鮮培養(yǎng)物"，如《中國藥典》中，在培養(yǎng)基靈敏度檢查部分，就再三強調這一點，“菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30°C～35°C培養(yǎng)18h～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上"（參考《中國藥典》 2020版  第157頁）……

二、試驗說明

  標準中之所以這么要求，是希望能用最god狀態(tài)的菌種，做出zui明顯的效果，保證試驗結果的可靠性。本文以平板上不同區(qū)域菌體的形態(tài)差別對此問題進行說明：分別將大腸埃希氏菌（典型的革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（典型的革蘭氏陽性菌），在TSA平板上三區(qū)劃線、培養(yǎng)，然后將每種菌分別從同一平板上的三個區(qū)域挑菌、涂片、鏡檢，觀察它們的菌體形態(tài)，為了方便觀察，涂片后先用結晶紫進行染色，再進行鏡檢觀察。結果如下（圖1、圖3）：

圖1 大腸埃希氏菌在平板上三區(qū)劃線培養(yǎng)后的菌落及菌體狀態(tài)

  大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5微米~0.5×3微米。從鏡檢結果不難發(fā)現(xiàn)，同一平板上不同區(qū)域長出的菌體，形態(tài)差別非常明顯：一區(qū)的菌體為短桿狀甚至點狀，有些菌體已經(jīng)明顯衰亡；二區(qū)桿狀形態(tài)的菌體明顯增多，且比一區(qū)的桿狀菌體較長、較粗；三區(qū)菌體全部為較長的桿狀且非常粗壯，與對數(shù)生長期菌體在掃描電鏡下的狀態(tài)基本一致（如圖2）。

圖2 掃描電鏡下對數(shù)生長期的大腸埃希氏菌形態(tài)

金黃色葡萄球菌，作為一種典型的革蘭氏陽性菌，三個區(qū)域內菌體差異雖然沒有那么顯著，但也呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律（如圖3）。

圖3 金黃色葡萄球菌在平板上三區(qū)劃線培養(yǎng)后的菌落及菌體狀態(tài)

三、討論：

  同一平板的不同區(qū)域的同一種菌呈現(xiàn)不同的形態(tài)，可以直觀解釋為一區(qū)菌體密度太大，二區(qū)次之，三區(qū)菌體密度較小所致。其根本原因在于，同等面積的區(qū)域上菌體密度過大，會造成菌體間營養(yǎng)競爭，有些菌體因為營養(yǎng)不良生長較差或長不出來，同時區(qū)域內的優(yōu)勢菌株還可能產生一些細胞毒素等，遏制其它菌體的生長。而三區(qū)內的菌營養(yǎng)比較充足，生長幾乎不受影響，所以菌體狀態(tài)最好。

  我們做實驗時，通常都會要求用生長狀態(tài)最幫的菌，有時候用新鮮菌體能做出很明顯的陽性結果，但如果菌體不新鮮，就會形成假陰性結果（參考氧化酶試驗的操作方法及注意要點）。

  綜上所述，在微生物試驗過程中，無論制作菌液還是進行菌株鑒定等，一定要注意菌體的新鮮度和菌體的健壯程度，盡量選用新鮮健壯的菌體進行試驗。如果是在平板上挑菌，我們通常挑取三區(qū)生長的單菌落進行后續(xù)試驗。

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