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上海牧榮生物科技有限公司

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使用 PROTRAP 進(jìn)行自上而下的樣品制備

閱讀:854      發(fā)布時(shí)間:2023-5-23
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準(zhǔn)備注意事項(xiàng)
ProTrap XG 設(shè)備經(jīng)過(guò)優(yōu)化,可處理 50 μg 蛋白質(zhì)。
對(duì)于可重現(xiàn)和最大的蛋白質(zhì)沉淀,沉淀過(guò)程中樣品中的最大SDS含量應(yīng)為1%。如果您的提取或裂解緩沖液含有超過(guò) 1% SDS,請(qǐng)使用最大離子強(qiáng)度為 300 mM 的緩沖液稀釋。
離心速度基于帶 24 x 1.5/2.0 mL 轉(zhuǎn)子的標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式微量離心機(jī)。
提供的時(shí)間僅供參考。
如果過(guò)濾濾芯中殘留的液體超過(guò)幾微升,請(qǐng)將其返回到離心機(jī)并重復(fù)旋轉(zhuǎn),或考慮提高旋轉(zhuǎn)速度。建議在后續(xù)旋轉(zhuǎn)中使用 3000 ×g (6000 rpm),ProTrap XG 已經(jīng)過(guò)高達(dá) 9000 ×g (10,000 rpm) 的測(cè)試。

所需材料
所有化學(xué)品和試劑應(yīng)為ACS級(jí)/HPLC級(jí)或更高。
丙酮
5 M 氯化鈉水溶液
80%甲酸水溶液(冷卻至–20°C)
冷凍水

自上而下的樣品制備方案

對(duì)于可重現(xiàn)和最大的蛋白質(zhì)沉淀,沉淀過(guò)程中樣品中的最大SDS含量應(yīng)為1%。如果您的提取或裂解緩沖液含有超過(guò) 1% SDS,請(qǐng)使用最大離子強(qiáng)度為 300 mM 的緩沖液稀釋。 為獲得最佳體驗(yàn),樣品應(yīng)至少含有 50 mM NaCl。 如果需要添加氯化鈉,請(qǐng)使用 5 M 氯化鈉溶液。

  • 不要讓過(guò)濾濾芯中的膜在步驟之間變干。

  • 將塞子擰到濾芯的底座上。 

  • 將 100 μL 稀釋的樣品蛋白轉(zhuǎn)移到堵塞的過(guò)濾柱中。

  • 加入 400 μL 室溫丙酮。

  • 蓋上過(guò)濾濾芯并輕輕搖晃,傾斜不超過(guò) 45°,以混合溶劑。 

  • 將過(guò)濾柱插入微量離心管中,等待 30 分鐘,使蛋白質(zhì)在室溫下聚集。

  • 連接塞子后,以 2500 × g (5000 rpm) 離心×2 分鐘。

  • 從微量離心管中取出過(guò)濾盒,倒置并擰下塞子。

  • 將帶蓋的過(guò)濾柱放回微量離心管中,并以 500 × (2000 rpm) 離心×3 分鐘。 丟棄通過(guò)溶劑的流量。 如果過(guò)濾濾芯中殘留任何溶劑,請(qǐng)以 3000 ×g (6000 rpm) 的速度重新旋轉(zhuǎn)裝置 2-5 分鐘。

  • 用 400 μL 丙酮清洗蛋白質(zhì)顆粒。立即以 500 × g (2000 rpm) × 2 分鐘離心。丟棄流過(guò)洗滌溶劑的流。

  • 更換插頭。在 –20°C 下將過(guò)濾筒中的沉淀物冷卻 10 分鐘。

  • 在水中加入 50 µL 冷 (-20°C) 80% 甲酸。蓋上濾芯,放入冰箱 10 分鐘,然后超聲處理 1 分鐘。

  • 加入 450 µL 冷凍水;蓋并渦旋以混合溶劑。

  • 完整的蛋白質(zhì)可以在干凈的微量離心管中直接回收,以 350 × g (2000 rpm) × 5 分鐘的速度離心。

如果需要進(jìn)一步的蛋白質(zhì)凈化,再溶解的蛋白質(zhì)也可以使用提供的可選 SPE 小柱和 SPE蛋白質(zhì)/肽凈化方案進(jìn)行 SPE 。


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