細(xì)胞解凍和培養(yǎng)指南

凍存的ATCC細(xì)胞株和雜交瘤細(xì)胞株在運(yùn)送過程中使用干冰保持低溫。收到凍存細(xì)胞后，可以立即解凍復(fù)蘇，去除二甲基亞砜（DMSO）后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。如果不立即復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，必須將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐氣相層存儲(chǔ)。請(qǐng)不要將細(xì)胞存儲(chǔ)在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低，達(dá)不到-130℃，細(xì)胞活力會(huì)迅速下降。

操作推薦

ATCC推薦在操作凍存的ATCC細(xì)胞株時(shí)使用手套，工作服和防護(hù)面具以避免任何事故發(fā)生。

檢查包裝，查看是否有任何破裂或滲漏。凍存的ATCC細(xì)胞株應(yīng)處于固體狀。

將凍存的ATCC細(xì)胞株從有干冰的包裝中取出，立即復(fù)蘇培養(yǎng)，或迅速轉(zhuǎn)移放置在液氮罐氣相層在-130℃以下的溫度存儲(chǔ)。

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)

1、先準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶，及產(chǎn)品說明推薦的相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)基。并在37℃水浴中預(yù)先溫?zé)峒?xì)胞培養(yǎng)基。（請(qǐng)參閱：注1）

2、小心取出裝有細(xì)胞的凍存管，保持管蓋擰緊，將凍存管蓋以下的部分置于37℃水浴中并輕微的攪拌以幫助解凍。解凍過程應(yīng)該盡快，大約短于2分鐘或待后一塊小冰晶體剛?cè)诨蛻?yīng)將細(xì)胞凍存管取出水浴。

3、在水浴中取出的細(xì)胞凍存管表面噴灑70%乙醇配制的消毒劑，用無菌紙巾或紗布拭干。之后的操作步驟都應(yīng)該遵循在無菌條件下生物安全柜中嚴(yán)格操作。

4、小心擰開凍存管的頂部，將管內(nèi)容物用1ml移液槍轉(zhuǎn)移到含9毫升培養(yǎng)基的無菌離心管中。離心5到7分鐘（125xg），小心吸去上清液以去除抗凍劑（二甲基亞砜），避免丟失細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸于配好的*培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻的分布。生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞株可重懸于5-8ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶。生長(zhǎng)較快的細(xì)胞株可重懸于12-20ml培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到T75培養(yǎng)瓶。

5、將細(xì)胞培養(yǎng)容器置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，在溫度37℃，二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后應(yīng)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。（請(qǐng)參閱：注2）

*注1：雖然大多數(shù)細(xì)胞株可以在一種以上的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但細(xì)胞的特征有可能會(huì)在更換不同培養(yǎng)基時(shí)發(fā)生。為保證好的效果，請(qǐng)從細(xì)胞培養(yǎng)一開始就使用ATCC推薦的培養(yǎng)基。

*注2：某些細(xì)胞株，如雜交瘤株，可能需要幾天的時(shí)間才從凍存狀態(tài)下*恢復(fù)正常生長(zhǎng)。在細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)天可能會(huì)呈現(xiàn)較低的細(xì)胞活力并產(chǎn)生一些細(xì)胞碎片。度過這一時(shí)期后，細(xì)胞會(huì)恢復(fù)并進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期。

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細(xì)胞株的生長(zhǎng)有兩種狀態(tài)，貼壁細(xì)胞需要附著在一個(gè)表面進(jìn)行生長(zhǎng)（貼壁依賴性），懸浮細(xì)胞可在懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下生長(zhǎng)（非貼壁依賴）。在細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)貨懸浮生長(zhǎng)中，都通常遵循四個(gè)特征性階段：遲滯期、對(duì)數(shù)或指數(shù)期、靜止或平臺(tái)期及衰退期。