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基于二氧化鈦富集策略的人類 磷酸化蛋白質(zhì)組大規(guī)模鑒定

閱讀:341          發(fā)布時間:2019-4-14
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蛋白質(zhì)磷酸化是一種非常重要的翻譯后修飾,其在細(xì)胞周 期、細(xì)胞增殖分化、代謝和凋亡等各個生物學(xué)過程中都起 到了重要的調(diào)控作用。在真核生物中,約有 1/3 的蛋白質(zhì) 處于其磷酸化狀態(tài),不同的蛋白質(zhì)其磷酸化水平差異很大, 從低于 1% 到高達(dá) 90% 不等[1]。

 

 

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)面臨著諸多技術(shù)挑戰(zhàn),如:磷酸化蛋白 質(zhì)豐度較低且動態(tài)范圍大,磷酸化肽段的離子化效率相 對偏低,磷酸修飾基團的具體位置難以確定,等等。在 目前的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,通常都需要在質(zhì)譜分 析前對樣品中的磷酸化肽段進行富集,以消除非修飾肽 段對于磷酸化肽段的鑒定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法 主要包括固定化金屬親和色譜(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)[3],二氧化鈦(Titanium dioxide, TiO2)[4] 以及基于抗體的富集方法[5]。其中二氧化鈦方法有 著富集效率高,簡單易操作的優(yōu)勢,從而成為了目前廣 泛使用的富集方法。為了進一步增加磷酸化位點的鑒定深 度,通常需要對磷酸化肽段進行預(yù)分級,包括采用離子 交換色譜[6],高 pH 反相色譜[7],親水相互作用色譜[8],以 及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在這部分工作中,我們采用 TiO2 富集結(jié)合多種肽段預(yù)分級的策略,通過 Orbitrap 采 集 HCD 產(chǎn)生的二級碎片離子,并終使用 MaxQuant 的 PTM score 系統(tǒng)進行磷酸化位點的確認(rèn),從而得到了高達(dá) 40,000 個位點的 Hela 細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組深度覆蓋。 

 

Hela 細(xì)胞用 SDT 裂解液裂解,并用 FASP 方法酶解[10]。 TiO2 富集磷酸化肽段的方法參考文獻[9]。肽段高 pH 反相 色譜預(yù)分級的方法參考文獻[7]。磷酸化肽段 SCX 分級的 方法參考文獻[11]。

色譜條件:液相色譜儀:Easy nLC 1200(ThermoFisher Scientific) 

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