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液相色譜對肝臟組織提取物中脂質(zhì)分析的影響
閱讀：954 發(fā)布時間：2022-3-7前言：脂質(zhì)組學(xué)屬于新興研究領(lǐng)域，其核心工作是生物系統(tǒng)中各種脂類物質(zhì)的表征和定量分析。質(zhì) 譜法是否能夠成功檢測和鑒定出給定樣品中的數(shù)千種潛在脂質(zhì)，將直接取決于脂質(zhì)液相色譜分離的策略。 肝臟、腦、心臟組織提取物是脂質(zhì)組學(xué)研究中常見的生物樣品。為證明色譜對脂質(zhì)組學(xué)分析 的影響，本應(yīng)用簡報以肝臟組織提取物為例，總結(jié)了使用反相 (RP) 和正相 (NP) 色譜分離不 同類型脂質(zhì)的優(yōu)勢。 本研究工作采用 Agilent UHPLC 1290液相色譜系統(tǒng)（包括二元泵、多孔板自動進(jìn)樣器和柱溫箱）進(jìn) 行。液相色譜通過安捷倫噴射流接口與 Agilent 6540 Q-TOF 聯(lián)用。采用反相和正相色譜兩種 方法分離組織提取物。
• 肝臟總脂質(zhì)提取物購自 Avanti Polar Lipids 公司（亞拉巴馬州阿拉巴斯 特），脂質(zhì)成分組成見上圖
• 將凍干的脂質(zhì)提取物復(fù)溶于 2:1 氯仿/ 甲醇溶液，然后用流動相 A 稀釋至 200 ng/µL
• 進(jìn)樣量 5 µL（含 1 µg 提取物），進(jìn) 行反相或
分析工作流程中數(shù)據(jù)分析的第一步是從結(jié)果 中提取分子特征，該特征由保留時間和質(zhì)量 數(shù)確定。此特征將化合物的所有特定加合物 和同位素的豐度濃縮為單個化合物的豐度。 分子特征提取由 Agilent MassHunter 定性 分析軟件（版本 B.07.00）通過 Agilent 分 子特征提取器 (MFE) 算法進(jìn)行，脂質(zhì)標(biāo)注 通過 Agilent METLIN 脂質(zhì) PCDL (B.07) 和 SimLipid 軟件（版本 4.20，PREMIER Biosoft 公司，加利福尼亞州帕羅奧圖）進(jìn) 行。METLIN 脂質(zhì) PCDL 包含 640 張通過化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品獲得的 MS/MS 譜圖。SimLipid 軟件支持脂質(zhì)譜圖的 MS/MS 理論匹配且包 含 36,224 個脂質(zhì)條目。
結(jié)果與討論 我們采用 MFE 算法對反相色譜法分離的肝 臟脂質(zhì)提取物進(jìn)行分析，得到了 4,108 種提 取化合物（特征）。然后我們在 METLIN 數(shù)據(jù)庫中搜索化合物，得到 1,000 余種帶有 脂質(zhì)標(biāo)注的化合物，單次液質(zhì)聯(lián)用分析僅耗 時 38 分鐘（圖 1）。
與基于親脂性（主要由碳鏈長度和雙鍵數(shù)確 定）的反相色譜脂質(zhì)分離相比，正相色譜分 離主要基于脂質(zhì)頭基的極性。圖 3 表明正相 色譜對于偏極性的脂質(zhì)和帶電脂質(zhì)的分離非 常高效。但會流失中性脂質(zhì)（如甾醇類、二酰甘油類和三酰甘油類），因為使用這類 流動相時中性脂質(zhì)不能得到色譜保留。對于 能夠檢測到的化合物，用戶可根據(jù)已知的脂 質(zhì)分類特征搜索相應(yīng)的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫，從而提 高脂質(zhì)標(biāo)注的準(zhǔn)確度。例如，我們可以將搜索范圍限制在 PE 脂質(zhì)中，具體方法有：在 限定的保留時間窗口中查詢洗脫化合物；僅 搜索 METLIN 脂質(zhì) PCDL 中 PE 子集下的 PE 條目或進(jìn)行自定義的 SimLipid 搜索。
表 1 所示為不同數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，數(shù)據(jù) 文件來自相同肝臟組織提取物在不同色譜法 和離子源條件下的分析。我們采用 MFE 算 法處理僅通過四極桿 1 獲取的數(shù)據(jù)文件。 所得化合物根據(jù) METLIN 脂質(zhì) PCDL 標(biāo) 注，也可以使用 SimLipid 軟件標(biāo)注。為 實現(xiàn)高準(zhǔn)確度的脂質(zhì)標(biāo)注，我們也對自動 MS/MS 數(shù)據(jù)文件進(jìn)行了 MFE 算法處理， 但只有含 MS/MS 數(shù)據(jù)的化合物才能用于數(shù) 據(jù)庫查詢?？墒褂?METLIN 脂質(zhì) PCDL 通 過譜庫匹配標(biāo)注化合物，也可以使用僅基于 MS/MS 數(shù)據(jù)的 SimLipid 軟件進(jìn)行標(biāo)注。
重點注意：與 METLIN PCDL（通過可靠 化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品獲得的高質(zhì)量專業(yè)譜庫）標(biāo)注不 同，SimLipid 標(biāo)注是將 MS/MS 譜圖與理 論模擬生成的 MS/MS 碎片譜圖進(jìn)行匹配。 以上示例表明分析人員可對色譜法進(jìn)行優(yōu)化 以用于不同類型脂質(zhì)的分析，反相和正相液 質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)在脂質(zhì)組學(xué)分析中具有各自的選 擇性優(yōu)勢。反相液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的適用范圍更 加全面，能夠分離多種不同類型的脂質(zhì)，實 現(xiàn)更多特征的檢測和標(biāo)注。另外，保留時 間具有很好的重現(xiàn)性，有助于色譜比對和差 異分析工作流程。正相液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的優(yōu)勢 在于能夠根據(jù)極性脂類的特征保留行為，對 其進(jìn)行更高準(zhǔn)確度的標(biāo)注。此外用戶還能夠 迅速通過色譜圖掌握樣品間脂質(zhì)種類的整體 差異。
結(jié)論：本文驗證了色譜法對復(fù)雜生物樣品中多種類 型脂質(zhì)進(jìn)行全面檢測和分析的能力。我們將 脂質(zhì)特異 UHPLC 方法與具有寬動態(tài)檢測范 圍的精確質(zhì)量 Q-TOF 聯(lián)用，并配合使用先 進(jìn)的特征查找軟件進(jìn)行自動化脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜 索，實現(xiàn)了在單次液質(zhì)聯(lián)用分析中檢測和標(biāo) 注出 1,000 余種脂質(zhì)。分析人員可對色譜方 法開發(fā)進(jìn)行優(yōu)化，以靶向分析不同類型的脂 質(zhì)，如我們使用兩種可選的液相色譜分離方 法 — 反相色譜和正相色譜對肝臟組織提取 物進(jìn)行的分離所示。從脂質(zhì)組學(xué)分析的角度 來看，這兩種方法具有各自的選擇性優(yōu)勢， 可使脂質(zhì)檢測覆蓋更加深入、全面。