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利用液質(zhì)聯(lián)用儀定量分析血漿中的兒茶酚胺類物質(zhì)
閱讀：1520 發(fā)布時(shí)間：2022-1-4摘要 本研究中開發(fā)出了一種用于血漿中去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺定量的靈敏度高、 特異性好的 LC/MS/MS 分析方法。采用 Agilent Captiva NDLipids 過濾產(chǎn)品和選擇性固 相萃取流程對血漿進(jìn)行凈化。此分析方法可達(dá)到所需的實(shí)用靈敏度，同時(shí)還能對相當(dāng)寬 動態(tài)范圍內(nèi)的分析物進(jìn)行定量分析。所有化合物均表現(xiàn)出出色的重現(xiàn)性 (CV < 5%)，且 所有校準(zhǔn)曲線都獲得了線性 (R2 > 0.9997)。
前言 本研究開發(fā)出的高效樣品前處理流程適用于 同時(shí)提取血漿中的去甲腎上腺素、腎上腺素 和多巴胺（圖 1）。將不同濃度的各種分析物 加入潔凈血漿中可制得校準(zhǔn)物。液相色譜/ 三重四極桿質(zhì)譜儀 (LC/MS/MS) 非常適用于 像上述多種分析物的快速分析。色譜系統(tǒng)采 用 Agilent Pursuit 五氟苯基 (PFP) 色譜柱以 及甲醇與 1 mM 氟化銨水溶液組成的流動相。 研究中對定量 MRM 離子對進(jìn)行監(jiān)測，并加 入了每種分析物的氘代內(nèi)標(biāo)以確保定量分析 的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。
實(shí)驗(yàn)部分：液相色譜方法 液相色譜系統(tǒng)由 Agilent 1290 Infinity 液相色譜二元泵、配備恒溫箱的孔板進(jìn)樣器以及 柱溫箱組成。如果使用的液相色譜系統(tǒng)具有 不同的延遲體積，則可能需要調(diào)節(jié)并驗(yàn)證梯 度以重現(xiàn)出相同的色譜分析結(jié)果。 質(zhì)譜方法 安捷倫 MS/MS 系統(tǒng)由采用安捷倫噴射流 技術(shù)的 Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜儀和 Agilent MassHunter 軟件 B.07.00 組成。
化學(xué)品與試劑 校準(zhǔn)物購自 Cerilliant (Round Rock, TX)、劍 橋同位素實(shí)驗(yàn)室 (Tewksbury, MA) 以及 Medical Isotopes 公司 (Pelham, NH)。DC Mass Spect Gold 血漿 MSG3000 購自 Golden West Biologicals (Temecula, CA)。 血漿內(nèi)分泌激素對照品 0010 和 0020 購自 ChromSystems。Burdick & Jackson LC/MS 級甲醇和試劑購自 VWR 和 Sigma-Aldrich。 將 5.75 g NH4H2PO4 溶解于 500 mL 水中， 并用 30% 的 NH4OH 將其 pH 調(diào)節(jié)為 10，以 制得 pH 為 10 的 100 mM NH4H2PO4 緩沖液。 樣品前處理 校準(zhǔn)物 (Cerilliant) 由潔凈的血漿基質(zhì) (Golden West Biologicals) 制得。采用同位素標(biāo)記的 內(nèi)標(biāo) (Cerilliant) 并對其濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其 響應(yīng)處于所需校準(zhǔn)曲線范圍的中部。實(shí)驗(yàn)采 用 ChromSystems 血漿對照品。重要信息： 在樣品分析之前，血漿應(yīng)冷凍保存于 –80 °C 下。采用含 0.5 M EDTA 和 317 mg/mL 焦亞硫酸鈉的穩(wěn)定劑
數(shù)據(jù)分析 Agilent MassHunter 定量數(shù)據(jù)分析軟件 (B0.07.00) 用于進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在校準(zhǔn)曲線 的線性回歸中采用 1/x 作為加權(quán)因子。在 MassHunter 定量軟件中，利用色譜峰面積 與已知濃度內(nèi)標(biāo)的峰面積之比進(jìn)行定量。
結(jié)果與討論 通過 PFP 色譜柱實(shí)現(xiàn)了所有分析物的色譜分 離（圖 2）。在每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)進(jìn)行額外的 清洗以獲得重現(xiàn)性。盡管未采用此方 法并進(jìn)行測定，但腎上腺素與去甲變腎上腺 素之間的分離以及以及變腎上腺素與 3-甲氧 酪胺之間的分離尤為關(guān)鍵，因?yàn)檫@些化合物 產(chǎn)生相同碎片。如果不根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行適 當(dāng)分離，這些化合物將相互干擾，導(dǎo)致不準(zhǔn) 確的定量結(jié)果。圖 3 顯示了這些化合物的分 離結(jié)果。 為研究 SPE 萃取流程的基質(zhì)效應(yīng)和回收率， 實(shí)驗(yàn)中配制并分析了 A、B、C 三組溶液。 這些混合物中包含 9 個(gè)不同濃度的全部三種 分析物及其內(nèi)標(biāo)。將溶液 A 加標(biāo)至 0.2% 甲 酸水溶液中，并進(jìn)樣分析。對溶液 B 中的潔 凈血漿進(jìn)行萃取后對其進(jìn)行加標(biāo)（萃取后）。 對溶液 C 中的潔凈血漿進(jìn)行加標(biāo)后對其進(jìn)行 萃?。ㄝ腿∏埃?。
基質(zhì)效應(yīng)和回收率的計(jì)算公式如下： 基質(zhì)效應(yīng)% = B/A × 100 回收率% = C/B × 100 A = 凈標(biāo)準(zhǔn)溶液 B = 萃取后加標(biāo)的血漿（萃取后） C = 加標(biāo)后萃取的血漿（萃取前） 三種被分析物的基質(zhì)效應(yīng)介于 42% - 119% 之間，而回收率介于 56% - 59% 之間（表 2）。 因此，雖然在結(jié)果觀察到了基質(zhì)效應(yīng)，但通 過內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償后仍獲得了可接受的回收率，如 表 3 和表 4 所示。 連續(xù)三天對校準(zhǔn)標(biāo)樣進(jìn)行萃取，以確定日間 精密度和準(zhǔn)確度。全部三種分析物均得到了 可接受的準(zhǔn)確度，且線性范圍內(nèi)所有濃度的 變異系數(shù)均小于 5%（表 3）。分別于連續(xù) 三天以及一天中三次對 ChromSystems 對 照品進(jìn)行萃取以確定日間和日內(nèi)的變異系數(shù)， 所得到的變異系數(shù)均小于 4%（表 4）。該方 法在濃度為 5 - 2500 pg/mL 的測定范圍內(nèi)具 有出色的線性，R2 值均大于 0.9997（圖 4）。
結(jié)論 本研究中開發(fā)出了一種用于血漿中腎上腺素、 去甲腎上腺素和多巴胺的穩(wěn)定定量分析方法。 利用 Agilent Captiva NDLipids 過濾和固相 萃取產(chǎn)品同時(shí)提取出全部三種分析物，并 獲得了良好的回收率。研究中還開發(fā)出與 LC/MS/MS 條件兼容的分析物的色譜分離 方法。