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分析苯并咪唑藥物的實驗方法
閱讀：745 發(fā)布時間：2019-9-25MS/MS 檢測 API 4000™ LC-MS/MS液質聯(lián)用系統(tǒng)，Turbo V™離子源，正離子 / 負離子模式，MRM掃描方式。
樣品制備（肉產品）[1]
1．試樣代表性部位，以搗碎機進行充分勻化。勻化后的試樣在分析前一直冷凍保存。
2．稱?。?.5±0.05) g均勻試樣置于離心管底部。分別制備四份空白組織試樣及一份對照試樣、三份 添加標準的試樣。在對照試樣中加入100 µL純DMSO。在組織試樣中加入50 µL DMSO。在空白組織試樣 和組織試樣中分別加入50 µL 10 µg/mL工作溶液。然后在已加入50 µL 10 µg/mL工作溶液的三個空白組織試 樣中分別加入50 µL 20、10、5 µg/mL工作溶液。
3．制備的每一試樣中加入2.5 mL 6 mol/L HCl，蓋好，將試樣管放到（110±4) ℃的烘箱內。
4．1 h后把試樣從烘箱中取出，將試樣管放于干冰或冰上約5 min，冷卻至室溫。
5．向每個試樣中加入2.0 mL水，以渦式混勻器混勻試樣，用pH計監(jiān)測pH值。慢慢加入足量(約1.23 g) 的碳酸鈉，加入時間需4～5 min，調節(jié)pH至8～9.5。
6．向每個試樣內加入15 mL乙酸乙酯，蓋上塞子，平放于試管架上，振搖5 min。然后取下塞子，于 4000 r/min將試樣離心5 min。
7．用吸移管將乙酸乙酯提取液轉入另一50 mL玻璃離心管內，應盡量轉移*。
8．重復操作步驟6和7，再次提取每個試樣，把相應的提取液合并于各自的50 mL離心管內。
9．向每個合并的乙酸乙酯提取液中加入4.0 mL 1 mol/L HCl，蓋上塞子，平放于試管架上振搖5 min。取 下塞子于4000 r/min離心5 min。
10．盡量*吸去乙酸乙酯相。在（35±5) ℃水浴上蒸去水溶液上殘留的乙酸乙酯。
11．用渦式混勻器將試樣混勻，同時慢慢加入足量(約0.33 g)碳酸鈉，加入時間需1～2 min。用pH計 監(jiān)測pH值，每個試樣的pH值應為8～9.5。
12．每個試樣中加入20 mL甲苯，蓋上塞子平放于試管架上振搖5 min，取下塞子于4000 r/min離 心5 min。
13．盡量*吸去甲苯相。在（35±5) ℃的水浴上蒸去水相上殘留的甲苯。
14．對于每一個試樣，相對應將一10 mL玻璃注射器用夾子固定在環(huán)形架上。注射器的路氏接頭前端 連接SEP-PAK C18柱體。
15．將每支柱用2 mL甲醇預洗，而后用2 mL 0.2 M磷酸鉀緩沖溶液(pH 8.0)洗滌。加入每種試劑后， 經過安裝于注射器頂部的橡皮塞緩緩通入氮氣，當氮氣開始出柱時即停氣。氮氣流速1～2 mL/min。棄去 洗脫液。
16．從步驟13中得到的每一試樣水相轉入預先洗滌好的各注射器柱系統(tǒng)內。用步驟14的方法，應用 氮氣使溶液流經柱體洗提，然后各取每一試樣管水洗液1 mL(經渦式混勻器混勻)，使用巴氏吸移管采用類 似方法將水洗液分別轉入各注射器柱系統(tǒng)內,棄去洗脫液。
17．再取每個試樣管水洗液1 mL(經渦式混勻器混勻)，分別轉入各注射器柱系統(tǒng)內，按步驟15的方 法應用氮氣使此水洗液流經柱體洗提,棄去洗脫液。
18．向每一注射器柱系統(tǒng)內分別加入2 mL甲苯，按步驟15的方法用氮氣使甲苯流經柱體洗提，棄去 洗脫液。
19．在每一注射器柱系統(tǒng)下面分別放置一15 mL離心管，向每個柱系統(tǒng)內加入2 mL乙酸乙酯，按步驟 15的方法用氮氣使乙酸乙酯流經柱體進行洗脫。在這部分洗脫液中含有待測化合物。
20．向步驟19中得到的每份洗脫液中分別加入約0.5 mL甲醇，混勻，得到均勻的溶液。
21．至干后加入0.5 mL水 — 甲醇溶液(70＋30)，混勻，重新溶解殘渣。
22．30 min后將每個重新溶解的試樣加入微量過濾裝置內，采用0.2 µm濾膜過濾。然后將每個過濾器 及試樣提取液于4000 r/min離心5～10 min。
23．將濾液轉入15 mL具塞玻璃離心管內，用水 — 甲醇(70＋30)調節(jié)每一濾液體積為0.5 mL?；靹蚝?移取0.1 mL供分析。
色譜分離條件 Agilent 1100 系統(tǒng)：G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動進樣器、柱溫箱。 色譜柱：Inertsil ODS-3 150 mm×2.1 mm。 流速：200 µL/min。 流動相：水 / 甲醇 + 5 mM 甲酸銨（pH=4.0）。 柱溫箱溫度：25 ℃；進樣體積：20 µL。MS/MS 檢測 API 4000™ LC-MS/MS液質聯(lián)用系統(tǒng)
