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分析硝基呋喃代謝物的實(shí)驗(yàn)方法
閱讀：990 發(fā)布時(shí)間：2019-8-1硝基呋喃類(lèi)抗生素藥物及其代謝物具有制畸胎副作用，且能誘發(fā)癌癥，引起了人們的高度關(guān)注。歐盟、美國(guó)、中國(guó)等諸多國(guó)家和地區(qū)先后禁止在動(dòng)物源性食品中使用，檢測(cè)限為不得檢出。硝基呋喃原藥對(duì)光敏感，在動(dòng)物體內(nèi)迅速被代謝，故檢測(cè)在食品中的代謝物。
化學(xué)試劑
硝基呋喃（nitrofuran）化合物名稱(chēng)、分子式和CA號(hào)：
呋喃它酮 3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon，其代謝物為AMOZ，C8H15N3O3，CAS: 43056-63-9
呋喃唑酮 3-Amino-2-oxazolidinone ，其代謝物為AOZ，C3H6N2O2，CAS: 80-65-9
呋喃西林 Semicarbazide，其代謝物為 SEM，CH5N3O，CAS: 57-56-7
呋喃妥因 1-Amino-hydantoin ，其代謝物為AHD，C3H5N3O2，CAS: 2827-56-7
硝基呋喃化合物及代謝物的結(jié)構(gòu)：
A：將藥物代謝物從組織中提取出來(lái)；B：藥物代謝物與2-硝基苯j(luò)ia醛(2-NBA，C7H5NO3，CAS: 552-89-6)的衍生化反應(yīng)。建議的內(nèi)標(biāo)：D4-AOZ，D5-AMOZ，13C15N2-SEM，13C3-AHD。
色譜分離流動(dòng)相的制備
1 M乙酸銨溶液：77 g乙酸銨溶解于1 L HPLC級(jí)的水中。
流動(dòng)相A：在1 L HPLC級(jí)的水中，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液。
流動(dòng)相B：在1 L HPLC級(jí)的甲醇中，加入1 mL 1 M 乙酸銨溶液。
樣品制備(肉、蝦樣品)
基于 Leitner 等人提出的方法[1]：
1． 稱(chēng)取1g勻漿的組織樣品；
2．加入內(nèi)標(biāo)；
3．加入0.125M鹽酸和2-硝基苯jia醛(2-NBA)；
4．調(diào)節(jié)pH值為7.4；
5．離心；
6．用乙酸乙酯在 Extrelut 柱上提取上清液；
7．揮干溶劑；
8．用500µL流動(dòng)相[水+1mM乙酸銨/甲醇＝90/10]。
回收率[2]：AOZ ～70%；AMOZ ～80%；SEM ～70%；AHD ～70%。
樣品制備(肝臟組織)
基于Conneely等人提出的方法[3]：
1．稱(chēng)量5g浸水并勻漿過(guò)的肝臟組織，衍生化過(guò)夜；
2．將樣品溶液pH值調(diào)成中性，用乙酸乙酯提取，揮干溶劑；
3．將殘?jiān)苡?/span>6mL水中，上樣到準(zhǔn)備好的MAX柱上；
4．先用2%氨水溶液3mL清洗，然后用3mL甲醇進(jìn)行洗脫，揮干溶劑；
5．將殘?jiān)苡?/span>3mL水中，上樣到準(zhǔn)備好的HLB柱上；
6．先用2%乙酸溶液(溶劑：水+甲醇＝1/1) 3mL清洗；
7．然后用3mL溶于90%甲醇中的2%的氨水溶液進(jìn)行洗脫。
樣品制備(蜂蜜樣品)
基于Blake等人提出的方法[1]：
1．加50µL內(nèi)標(biāo)溶液到5g蜂蜜中；
2．熱水中超聲5min，使混合均勻；
3．加入20mL 0.3M鹽酸(混合300mL 1M HCl和700mL的水制成)，振搖使均勻；
4．加入1mL衍生化試劑(將1g 2-NBA溶解于50mL二甲亞砜DMSO中制成，用前新鮮配制)；
5．渦流混旋1min，使混合均勻，37℃保溫16h進(jìn)行衍生化；
6．加入2mL 1M磷酸緩沖液(磷酸緩沖液pH=7.4)，加入1M NaOH(7.3～8.2mL)到溶液pH=7±0.5，注
意：pH值不可以超過(guò)7.5；
7．加入15mL HPLC級(jí)的乙酸乙酯，渦旋混合5min；
8．在3000r/min離心10min，直至有機(jī)相與水相明顯分層，如果沒(méi)有很好分層，繼續(xù)離心；
9．仔細(xì)轉(zhuǎn)移上面乙酸乙酯層溶液5mL，到一干凈的16mm×100mm的玻璃試管中，注意不要將下面水層溶液帶入；
10．蒸發(fā)到只剩1mL左右；
11．再仔細(xì)轉(zhuǎn)移出3mL上層乙酸乙酯溶液，到相同玻璃試管中；
12．蒸發(fā)到只剩1/2時(shí)，渦旋混合，再蒸發(fā)至干；
13．加入200µL甲醇進(jìn)行溶解，再加入200µL水，混合均勻。然后取出200µL到樣品瓶中，備用。
色譜分離條件
Agilent 1100 系統(tǒng)：G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱。
色譜柱：Phenomenex LUNA，3µm，C18(2)，150mm×2mm。
流動(dòng)相：A相—水+1mM 乙酸銨；B相—甲醇+1mM 乙酸銨。
MS/MS檢測(cè)
API 3000™ LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀系統(tǒng)，TurboIonSpray® 離子源，正離子模式，MRM掃描方式。
