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電導(dǎo)檢測器檢測達(dá)肝素鈉中亞硝酸根-賽默飛離子色譜
閱讀：585 發(fā)布時間：2019-6-4低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）是近年發(fā)展起來 的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用低于肝 素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、體內(nèi)半衰期長、出血傾向小 等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。根據(jù)LMWH的來源、生產(chǎn)工藝、末端結(jié)構(gòu) 的不同，LMWH分為許多不同的種類，如達(dá)肝素鈉、依諾肝素、納肝素鈣、 帕肝素鈉、汀肝素鈉等。達(dá)肝素鈉（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一 種，由亞硝酸降解肝素得到，重均分子量5600-6400，峰位分子量6000，硫 酸化程度為2.0-2.5/雙糖單位[1]。
達(dá)肝素鈉的生產(chǎn)過程中使用了亞硝酸，而亞硝酸根是一種毒性物質(zhì)，在 人體特定的環(huán)境條件下，可以合成一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌物——N-亞硝基化合 物，能夠誘發(fā)幾乎所有內(nèi)臟器官的腫瘤。因此，檢測達(dá)肝素鈉中殘留的亞硝 酸根含量，對保證患者用藥安全具有重要意義。目前歐洲藥典使用離子色譜安培檢測法測定達(dá)肝素鈉中亞硝酸根含量[2]，國內(nèi)低分子肝素標(biāo)準(zhǔn)中使用化學(xué) 方法對亞硝酸根進(jìn)行限度檢查，無含量測定[3]。歐洲藥典的方法未對樣品進(jìn)行 前處理，達(dá)肝素鈉保留在色譜柱上，縮短柱壽命，且重現(xiàn)性較差。本文建立 了離子色譜法分離、電導(dǎo)檢測器檢測達(dá)肝素鈉中的亞硝酸根含量的方法，靈 敏度高，線性、回收率、重現(xiàn)性好，可以延長色譜柱壽命。
測試條件
儀器：戴安ICS 3000離子色譜系統(tǒng)（EG淋洗液發(fā)生裝置）； 分析柱：IonPac AS19，250×4 mm； 保護(hù)柱：IonPac AG19，50×4 mm； 柱溫：30 ℃； 淋洗液：氫氧化鉀（KOH） 梯度淋洗；5-40 mmol/L KOH，0-35 min； 40-5 mmol/L，35-35.1min； 流速：1.00 mL/min； 定量環(huán)：100 µL 抑制器：AMMS 4 mm，再生液為25mmol • L-1硫酸
檢測方式：抑制型電導(dǎo)
樣品前處理
精密稱取達(dá)肝素鈉0.4 g，加水溶解并稀釋至10 mL。 精密量取1 mL至離心管中，加無水乙醇9 mL，搖勻， 10000 r • min-1離心20 min。取上清液，過0.22 µm濾膜， 續(xù)濾液進(jìn)樣。
結(jié)果和討論
樣品前處理條件的選擇
由于達(dá)肝素鈉是多羥基的多糖類物質(zhì)，堿性條件下離 子化，在離子交換柱上有很強(qiáng)的保留，即使使用強(qiáng)的洗脫 溶液如1 mol • L-1氯化鈉也很難將其洗脫。達(dá)肝素鈉侵占色 譜柱中的位點，可造成色譜柱容量下降，離子保留時間縮 短。去除待測液中的達(dá)肝素鈉后進(jìn)樣，可解決這一問題。
去除達(dá)肝素鈉的方法主要有乙醇沉淀、陽離子表面活 性劑沉淀、超濾、透析等。陽離子表面活性劑的引入，會 降低色譜柱的柱效；超濾膜可能含有亞硝酸根殘留，影響 測定結(jié)果；透析需要的時間較長。與以上三種方法相比， 醇沉操作簡單、快捷，重現(xiàn)性好，且不易引入雜質(zhì)，因此 本方法選用醇沉法對樣品進(jìn)行前處理。
色譜柱的選擇
樣品溶液含有的陰離子，除達(dá)肝素鈉正常含有的硫 酸根、殘留的亞硝酸根外，還含有氯離子、磷酸根離子 及其他未知陰離子。分別使用IonPac AS11-HC，IonPac AS15，IonPac AS19，IonPac AS23等色譜柱進(jìn)行分離。 在氯離子和亞硝酸根之間出現(xiàn)未知色譜峰，保留時間與亞 硝酸根接近。降低淋洗液濃度，可增加未知峰與亞硝酸根 的分離度，但同時也造成分析時間延長。比較以上不同色 譜柱的測定結(jié)果，在保證未知峰與亞硝酸根分離度的前提 下，IonPac AS19色譜柱的分析時間短，亞硝酸根出峰 時間可控制在10 min以內(nèi)。IonPac AS19色譜柱良好的分 離效果與其高容量有關(guān)。
抑制模式的選擇
使用電導(dǎo)檢測器時，淋洗液有很高的檢測信號。抑 制器可降低淋洗液的背景電導(dǎo)，增加被測離子的電導(dǎo) 值，改善信噪比。常用的抑制模式有化學(xué)抑制、電抑制 等。測定陰離子時，化學(xué)抑制使用酸作為再生液；電抑 制使用外接水或電導(dǎo)池后流出的廢液作為再生液。本方 法的待測溶液中含有高濃度的乙醇，在電抑制模式下， 乙醇有響應(yīng)且會干擾亞硝酸根的測定，而化學(xué)抑制模式 下乙醇無響應(yīng)值。因此，本法采用25 mmol • L-1硫酸作為 再生液，選用膜抑制器化學(xué)抑制。
重現(xiàn)性、線性和靈敏度
取樣品溶液分別進(jìn)樣6次，保留時間RSD為0.1%，峰 面積RSD為0.5%. 線性范圍 取25～1000 µg • L-1亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn) 樣，以峰面積A對濃度C進(jìn)行回歸計算，回歸方程為： A=0.000787C+0.001007, r=0.9997 取20μg • L-1的亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，測定其峰高 微0.060 µS，按照3倍信噪比計算其檢測限為1 µg • L-1，按 照10倍信噪比計算其定量限為3.3 µg • L-1。
實際樣品分析及加標(biāo)回收
精密稱取樣品適量，精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量加入， 分別制成加標(biāo)濃度為25，50，100，200 µg • L-1的溶液， 回收率分別為98.5%～107.9%（n=3），見表1。
結(jié)論
綜上所述，本文建立的亞硝酸根的測定方法，不僅 操作簡單，靈敏度高，更具有重現(xiàn)性高，更好的保護(hù)色 譜柱等優(yōu)點。本方法不僅可用于低分子肝素的質(zhì)量控 制，其前處理方法和檢測方法也適用于其他多糖類藥物 中的陰離子測定。