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引言：左旋肉堿（L-carnitine, β-羥基γ-*銨丁酸）又稱(chēng)肉毒堿或維生素BT， 其化學(xué)式為C7H15O3N，分子量為162.2，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類(lèi)氨基 酸。L-肉堿的主要功能是參與動(dòng)物體內(nèi)的脂肪代謝，它作為載體將長(zhǎng)鏈脂肪酸 從腺粒體膜外輸送到膜內(nèi)，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化，從而促進(jìn)脂肪的代謝，因 此左旋肉堿具有多種重要的生理功能[i,ii]。左旋肉堿已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和 食品等領(lǐng)域，被瑞士、法國(guó)、美國(guó)和世界衛(wèi)生組織規(guī)定為法定的多用途營(yíng)養(yǎng) 劑。我國(guó)食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760-1996規(guī)定了左旋肉堿酒石酸鹽為食品 營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，可應(yīng)用于咀嚼片、飲液、膠囊、乳粉及乳飲料等。市場(chǎng)上已出現(xiàn) 了許多以左旋肉堿為主要功能的減肥產(chǎn)品。

 

左旋肉堿極性較強(qiáng)，缺少發(fā)色基團(tuán)，定量分析困難。國(guó)內(nèi)外對(duì)左旋肉堿的 測(cè)定主要有酶法[iii,iv]、電泳法[v]、電化學(xué)法[vi]，液相色譜法[vii~xiii]等。液相 色譜法中有的需要衍生、有的靈敏度較低。其它方法準(zhǔn)確性較差，設(shè)備較貴等 原因較少使用。

 

離子色譜法可測(cè)定在水溶液中能電離的物質(zhì)。在酸性溶液中，左旋肉堿表 現(xiàn)為陽(yáng)離子特性，帶正電荷，可用陽(yáng)離子交換色譜柱分離。但左旋肉堿的兩性 特征使其無(wú)法采用抑制型電導(dǎo)檢測(cè)。為此，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)，摸索出左旋肉堿的 非抑制型離子色譜測(cè)定的新方法。該方法前處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，用于實(shí)際樣 品的檢測(cè)，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

 

 

測(cè)試條件
儀器：賽默飛戴安ICS系列離子色譜系統(tǒng)帶柱溫箱。 分析柱: IonPac CS17 + IonPac CG17，4 mm
流動(dòng)相組成：
MSA：0-22 min，5 mM；流速：1 mL/min 柱溫：30 ℃
檢測(cè)方式：抑制型電導(dǎo)檢測(cè)
進(jìn)樣量：25 µL 

 

樣品前處理
膠囊：拆開(kāi)膠囊外皮，稱(chēng)取其中的粉末樣品約0.1 g 至100 mL容量瓶中，用超純水定容到100 mL后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液，4000 r/min離 心20 min后，將溶液通過(guò)0.22µm尼龍濾膜和OnGuard II RP柱，棄去6 mL初始流出液后采集2 mL樣品用于離子色 譜測(cè)定。

咀嚼片：將咀嚼片粉碎，混勻，稱(chēng)取其中的粉末樣 品約0.1 g至100mL容量瓶中，用超純水定容到100 mL 后，室溫超聲提取30 min，靜置30 min，取上層清液， 4000 r/min離心20 min后，將溶液通過(guò)0.22µm尼龍濾膜和 OnGuard II RP柱，棄去6 mL初始流出液后采集2 mL樣品 用于離子色譜測(cè)定。

OnGuard II RP柱（2.5 cc），預(yù)先使用10 mL甲醇和 15 mL水活化。

 

 

結(jié)果與討論
1. 前處理?xiàng)l件的選擇

減肥產(chǎn)品中，通常加入左旋肉堿穩(wěn)定形式的左旋肉 堿酒石酸鹽。左旋肉堿酒石酸鹽易溶于水，但不易溶于有 機(jī)溶劑。離子色譜的淋洗液是水溶液，因此選用水作提取 劑。對(duì)用水作溶劑提取極性化合物，超聲提取是有效的提 取方法。我們考察了用超聲提取時(shí)，提取溫度與提取時(shí)間 對(duì)回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1和表2。 

從表1數(shù)據(jù)可見(jiàn)，增加提取時(shí)間，測(cè)得結(jié)果逐漸增 大，當(dāng)提取時(shí)間大于20 min后，提取效率增大不明顯了。 考慮到某些基體復(fù)雜的減肥產(chǎn)品，可將提取時(shí)間適當(dāng)延 長(zhǎng)，因此提取時(shí)間選擇為30 min。表2中，30 ℃時(shí)測(cè)得左 旋肉堿含量已經(jīng)是50 ℃時(shí)的99.9%，這說(shuō)明30 ℃左旋肉 堿的提取已經(jīng)充分。因此選擇在30 ℃、30 min下超聲提取 即可。

2. 色譜柱的選擇
按實(shí)驗(yàn)方法，我們比較了左旋肉堿在IonPac SCS1、 IonPac CS12A、IonPac CS17三種不同色譜柱上的出 峰及分離情況。SCS1柱為硅膠基質(zhì)的色譜柱，不耐酸 堿，雖然可用低濃度（3 mM）的淋洗液等度洗脫，但L肉堿在該柱拖尾嚴(yán)重，對(duì)稱(chēng)因子為4.05，靈敏度不高。 CS12A柱的離子交換功能基團(tuán)為羧基/磷酸基，柱容量 高（2800 ueq），親水性較CS17柱弱，對(duì)一價(jià)和二價(jià) 陽(yáng)離子的保留相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)疏水性比較強(qiáng)的L-左旋肉堿 離子保留比較強(qiáng)，需用高濃度的淋洗液才能洗脫保留的 陽(yáng)離子，這會(huì)導(dǎo)致高的背景電導(dǎo)和高的檢出限。采用 15.56 mM的甲基磺酸在CS12A柱上等度淋洗左旋肉堿

背景電導(dǎo)5371 uS，色譜峰的對(duì)稱(chēng)因子2.25，理論塔板數(shù) 1936，可見(jiàn)對(duì)稱(chēng)性和柱效也不好。CS17柱功能基團(tuán)為 羧酸基，柱容量（1450 ueq）較CS12A柱低，可用較低 濃度的淋洗液洗脫一價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子，因此降低背景電 導(dǎo)，提高檢出限。L-肉堿在此色譜上對(duì)稱(chēng)性良好，5 mM 等度淋洗，對(duì)稱(chēng)因子為1.17，與可能存在的其它陽(yáng)離子 易于分開(kāi)。因此，選擇CS17 + CG17作為分析L-左旋肉堿 的色譜柱。

 

3. 淋洗液濃度的確定
我們選用不同濃度的甲基磺酸，測(cè)定混合標(biāo)樣a中左 旋肉堿的色譜分析特征。隨著淋洗液濃度降低，背景電導(dǎo) 降低，噪聲降低，理論塔板數(shù)提高，各成分間的分離度增 大，對(duì)稱(chēng)因子降低，峰形改善（如表3所示）。但由于濃 度降低，酸度降低，導(dǎo)致峰高降低，靈敏度降低。因?yàn)長(zhǎng)肉堿是弱堿，溶液的酸度減弱，L-肉堿的解離減弱，電導(dǎo) 響應(yīng)也將減弱。同時(shí)，更低濃度的酸使各成分的保留時(shí)間 明顯增長(zhǎng)，特別是兩價(jià)離子的保留時(shí)間增加更多，當(dāng)濃度 降低到3 mmol/L時(shí)，Ca2+離子的保留時(shí)間大于50 min，不 利于提高分析效率（如表4所示）。綜合考慮，我們選擇 5 mmol/L的甲基磺酸作為分析用淋洗液。

 

4. 干擾實(shí)驗(yàn)
由于鉀、鈉、鈣、鎂、銨為水中的常見(jiàn)離子，在樣 品中普遍存在。而某些含左旋肉堿的保健產(chǎn)品也會(huì)添加膽 堿類(lèi)類(lèi)物質(zhì)例如膽堿及乙酰膽堿來(lái)促進(jìn)脂肪運(yùn)輸和神經(jīng)發(fā) 育。因此我們考察了常見(jiàn)陽(yáng)離子及膽堿和乙酰膽堿對(duì)左旋 肉堿出峰的影響。從圖1可見(jiàn)，常見(jiàn)六種陽(yáng)離子能與左旋 肉堿較好分離。50 mg/L的膽堿和乙酰膽堿與400 mg/L的 左旋肉堿出峰互相不干擾，分離度達(dá)到2.72．

 

5. 檢出限與線(xiàn)性范圍
按實(shí)驗(yàn)方法在選定的色譜條件下，對(duì)左旋肉堿進(jìn)行 線(xiàn)性和檢出限測(cè)定。檢出限按照S/N=3進(jìn)行測(cè)算，Noise= 0.06 µS。數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。在選定的濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性相關(guān)系 數(shù)r>0.999。左旋肉堿檢出限1 mg/g。

 

6. 精密度與回收率 按實(shí)驗(yàn)方法，取減肥產(chǎn)品進(jìn)行不同濃度加標(biāo)試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定左旋肉堿平均回收率和精密度，結(jié)果 列于表5，該方法的回收率在87.9%~106%之間，RSD小 于6.6%。

實(shí)際樣品分析
按實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)市售標(biāo)示含有左旋肉堿的減肥產(chǎn)品進(jìn) 行了測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表7及圖2。

 

結(jié)論
采用非抑制型賽默飛戴安ICS系列離子色譜來(lái)測(cè)定左旋肉堿具有簡(jiǎn) 單、快速、干擾少、環(huán)保等特點(diǎn)。相比常見(jiàn)液相色譜方 法，無(wú)需衍生化，避免了繁瑣的操作，節(jié)約時(shí)間，重復(fù) 性好。該方法可用于減肥產(chǎn)品中左旋肉堿的含量測(cè)定。