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熱原（內(nèi)毒素）檢測

鑒于熱原對人體的不良反應的效果和多樣性，注射用藥終產(chǎn)品放行都必須強制進行細菌內(nèi)毒素測試（BETs），以確?；颊哂盟幇踩?。在制藥行業(yè)，特別是注射用藥，對細菌內(nèi)毒素進行可靠和有效的檢測是重要環(huán)節(jié)。標記為無熱原或無菌的注射或植入產(chǎn)品必須進行內(nèi)毒素檢測放行。許多原材料檢查也必須進行內(nèi)毒素檢測方能用于GMP生產(chǎn)，以達到設計標準的質(zhì)量要求。

家兔熱原檢測法（RPT）

家兔的體溫變化非常敏感，它們對許多病毒和致病菌非常敏感，具有能客觀反映各類藥品中熱原在生物體內(nèi)引起發(fā)熱情況的特點。通過家兔的預先感染，可以進行許多抗傳染藥物的研究，因此可以作為熱原試驗的實驗動物模型，常作為研究發(fā)熱、解熱藥和檢查致熱原。雖然兔子是常用的試驗動物，但人類被認為是對熱原敏感的動物。

Seibert在1923提出用家兔檢測熱原，該方法于1942年被美國藥典收錄，簡稱“家兔法”（RPT），是用于藥品和醫(yī)療器械熱原體內(nèi)檢測的方法。中國藥典1953年版開始收載該方法，隨后的世界各國藥典都以動物熱原檢查法作為藥品質(zhì)量監(jiān)測的方法之一。歐洲藥典也于1986年發(fā)布該方法，通過測量兔子通過靜脈注射待測物質(zhì)的無菌溶液引起的體溫升高進行檢測。家兔熱原檢查法可在規(guī)定時間里觀察到家兔的體溫變化，相應反應了熱原質(zhì)引起哺乳類動物復雜的體溫反應過程，為保障藥品質(zhì)量和用藥安全發(fā)揮了重要作用。

單核細胞活化反應測定法(MAT)

但RPT也存在各種局限性，例如：靈敏度較低、無法區(qū)分Endotoxin和NEP；試驗動物受到藥品的藥理活性干擾，而影響體溫變化（如放射性藥品、抗生素、生物制品等），實驗結(jié)果難以判斷；無法應用于非靜脈注射藥物；兔子致命的過敏性休克的可能性；動物飼養(yǎng)和測試設備及實驗費用；屬于定性反應，實驗結(jié)果和熱原很難進行量的換算。

鑒于這些限制，以及歐盟為減少動物用于科學目的所做的努力，歐洲藥典2010在通則2.6.30新增單核細胞活化試驗(MAT)熱原檢測方法，為RPT提供了一種體外替代方案，能夠檢測內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素熱原，在動物福利方面向前邁出的重要一步。USP<151>也收錄了MAT熱原檢測方法。2020年版《中國藥典》通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”中增加單核細胞活化反應測定法(MAT)方法。用于滿足技術(shù)藥物發(fā)展的現(xiàn)狀和解決傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢查法不能滿足新型產(chǎn)品安全性控制需求這個難題。

單核細胞活化反應測定法(MAT)原理

細菌內(nèi)毒素的鱟試劑檢查法（LAL/TAL）

細菌內(nèi)毒素檢查法又稱鱟試劑法，是利用鱟試劑與細菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應，以檢測或量化藥品中因革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素含量是否符合規(guī)定的一種方法。此法以其快速、靈敏、經(jīng)濟、重現(xiàn)性好等特點得到了日益廣泛的應用，并有取代傳統(tǒng)的熱原檢查法的發(fā)展趨勢。

美國動物學家FredericBang在1956年研究鱟的血液循環(huán)時，和助手JackLevin發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素導致的凝血機理。1968年，他們初步闡明這種血液凝固是由于革蘭陰性細菌內(nèi)毒素激活了鱟血變形細胞溶解物的酶，使溶解物中的可溶性蛋白變成凝膠，這種凝固反應靈敏。開發(fā)出了一種的細菌檢測劑——鱟試劑（LAL，LimulusAmebocyte Lysate，鱟阿米巴樣細胞裂解物）。

內(nèi)毒素檢測方法發(fā)展史
 

根據(jù)鱟血來源不同，一般分為LAL（美洲鱟試劑）/TAL（東方鱟鱟試劑），鱟試劑檢測法是一種可靠、靈敏、特異性強的內(nèi)毒素檢測方法，也是監(jiān)管機構(gòu)主要的方法，應用廣泛。

基于鱟試劑發(fā)展出來的主要內(nèi)毒素檢測方法包括兩種：凝膠法和光度測定法，后者又包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試樣品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法檢測結(jié)果為準。細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EndotoxinUnit, EU）表示。

模擬鱟試驗級聯(lián)反應階段，2003年以來，基于重組因子C（rFC）的細菌內(nèi)毒素檢測方法由于可替代動物源鱟試劑和原料可控性、抗干擾能力強等特點，被廣泛用作內(nèi)毒素檢測的替代方法。有研究比較了LAL方法和rFC檢測數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示幾種方法的檢測結(jié)果是可比的。重組C因子內(nèi)毒素檢測方法可以用于藥典凝膠法和光度法的有效替代。
 

不同鱟試劑檢測方法和重組C因子檢測方法檢測結(jié)果比較

(KQCL-Lonza動態(tài)顯色法試劑盒；PyroGene-Lonza重組C因子法試劑盒；QCL-Lonza終點顯色法試劑盒；Turb-Lonza動態(tài)濁度法試劑盒)

因此，目前行業(yè)內(nèi)共有四種常見的細菌內(nèi)毒素檢測方法：凝膠法、比濁法、顯色法和rFC法，并在注射劑和醫(yī)療器械生產(chǎn)過程控制和產(chǎn)品放行質(zhì)控檢測中有著重要的應用。比濁法、顯色法和rFC法是定量方法，凝膠法為定性或者半定量方法。每種方法都有自己的特點，使用者可以根據(jù)自己的樣品屬性、檢測需求和實驗室設備情況和法規(guī)要求進行相應選擇，以達到內(nèi)毒素控制和熱原控制的效果，患者安全。
 

內(nèi)毒素檢測方法

Lonza內(nèi)毒素檢測產(chǎn)品一直走在行業(yè)

Lonza（龍沙）內(nèi)毒素產(chǎn)品于1970年代面世。半個世紀以來，為客戶提供包括細菌內(nèi)毒素檢測試劑盒、內(nèi)毒素檢測軟件、全自動內(nèi)毒素檢測儀器在內(nèi)的一站式解決方案，符合FDA21 CFR part 11和歐盟EUGMP附錄11法規(guī)要求，以服務于各類細胞制劑生產(chǎn)企業(yè)、制藥企業(yè)質(zhì)控部門，可植入醫(yī)療設備和透析樣品質(zhì)控以及科研院所等相關(guān)機構(gòu)，其服務對象覆蓋多數(shù)制藥企業(yè)，已用于國外藥物的放行，滿足出口型制藥企業(yè)的規(guī)?；療嵩礈y定需求。

產(chǎn)品包括：鱟試劑凝膠法試劑盒；基于鱟試劑，用于定量檢測的動態(tài)顯色法試劑盒，動態(tài)濁度法試劑盒；不依賴于鱟試劑的重組C因子檢測試劑盒。LAL試劑可以實現(xiàn)產(chǎn)品的穩(wěn)定供應。

此外，Lonza還提供PyroCell®MAT單核細胞活化反應測定法系統(tǒng)，高度敏感和可靠的用于復雜配方（如人類疫苗和基于細胞的生物制劑）的體外熱原檢測。
 

Lonza內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)及組成（試劑盒、軟件、儀器、自動化及周邊耗材試劑）

Lonza LAL鱟試劑及重組C因子內(nèi)毒素檢測系統(tǒng)產(chǎn)品特點：

• 行業(yè)準

• 認可，雙報優(yōu)勢（中歐、中美）

• 不同檢測方法及產(chǎn)品可選（4種方法）

• 檢測解決方案（試劑盒、儀器、軟件、耗材）

• 可自動化（濁度法、顯色法、rFC方法）

• 長時間使用經(jīng)驗積累和口碑基礎

• 儀器軟件兼容性廣，適合大多數(shù)用戶

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