轉(zhuǎn)自：羅氏診斷生命科學(xué)公眾號
小羅：大家好，本堂課小羅將帶領(lǐng)大家繼續(xù)學(xué)習(xí)數(shù)字PCR，分析一下Digital PCR workflow影響檢測性能的各因素。
基于泊松分布將核酸樣本分散到大量微孔或者液滴中（如圖1），相較于qPCR而言，dPCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2），抑制成分被有效稀釋（如圖3），讀取結(jié)果方式具備更精確結(jié)果的潛力。盡管有諸多優(yōu)勢，我們?nèi)孕柚匾昫PCR的操作過程、試劑耗材穩(wěn)定性及硬件性能帶來的影響；同時需針對性的完善實驗細(xì)節(jié)，從而盡可能減少引入的偏差，獲得高靈敏度、高穩(wěn)定性的實驗結(jié)果。
圖1.dPCR實驗原理圖例
（來源：羅氏診斷整理）
圖2.無需依靠通過標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線
（來源：羅氏診斷整理）
圖3.將樣本分散到微孔后可以降低體系抑制成分的抑制效果
（來源：羅氏診斷整理）
完整的數(shù)字PCR操作流程：
取樣過程：
a.
絕大多數(shù)生物學(xué)實驗在取樣過程中會引入取樣偏差，因此在此操作過程中應(yīng)盡量保持取得樣本的操作一致，并且在不提高抑制物濃度的條件下，應(yīng)盡量增大取樣體積，選取低吸附樣本管的耗材。
針對樣本本身，如果是全基因組核酸進(jìn)行數(shù)字PCR研究則需要進(jìn)行片段化處理。細(xì)菌，病毒等樣本通常需要結(jié)合多重靶標(biāo)檢測，實驗設(shè)計時需分析靶點序列在基因組上的物理距離，并針對性的設(shè)計靶點引物或酶切干預(yù)來減少后續(xù)結(jié)果中出現(xiàn)的多靶標(biāo)連鎖問題。
體系配置：
b.
此步驟主要涉及移液偏差。dPCR儀器移液步驟越多，誤差越大，因此在此操作過程中盡可能減少移液次數(shù)，同時選擇校準(zhǔn)過的靠近量程的移液器結(jié)合合適的低吸附槍頭（如圖4）。
移液操作通常為反向移液，對于低濃度樣本盡可能增加重復(fù)以防止低分子隨機(jī)性因素導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定，高濃度探針引物稀釋后移液可以減少批間誤差。以手動單道移液器為例（如圖5），同樣是移取20 μl液體，選擇量程是20 μl的移液器時精度≤±0.8%，換算成體積為±0.16μl；而選擇量程是200μ的移液器時精度為≤±6%，體積偏差在±1.2μl 。
圖4.dPCR加樣時吸頭角度
（來源：羅氏診斷整理）
圖5.針對不同量程移液器移液過程的誤差數(shù)據(jù)
（來源：羅氏診斷整理）
分散過程：
c.
有效反應(yīng)單元數(shù)量是影響結(jié)果準(zhǔn)確性和精確性的重要因素（如圖6）。以泊松分布為基礎(chǔ)來測算核酸濃度，需要在精度和動態(tài)范圍之間取得平衡。相同反應(yīng)單元下，精度要求越高，動態(tài)范圍越小，精度要求越小，動態(tài)范圍越大，因此提高有效反應(yīng)單元數(shù)量，可同時提高精度和動態(tài)范圍。
圖6.20k,28k,100k微孔數(shù)目下，芯片孔越多，計算核酸濃度的準(zhǔn)確性越高
（來源：羅氏診斷整理）
在反應(yīng)單元一致的前提下，樣本體積越大，越有利于低拷貝基因的檢測。
分散過程中的誤差分析：統(tǒng)計學(xué)樣本濃度均值λ，即平均一個分區(qū)單元包含λ個拷貝不一定剛好是真實模板濃度，需要結(jié)合置信區(qū)間和置信水平表示,數(shù)字PCR中置信水平通常是95%，而針對置信區(qū)間科研和商業(yè)化公司有多種計算方式。
???絕對定量誤差分析，見圖例CI區(qū)間（如圖7）。
圖7.dPCR絕對定量結(jié)果CI統(tǒng)計區(qū)間
（來源：羅氏診斷整理）
???CNV誤差分析更為復(fù)雜，需要目標(biāo)基因和內(nèi)參基因濃度比ratio值及相應(yīng)的聯(lián)合置信區(qū)間進(jìn)行表示，見圖例CI區(qū)間（如圖8）。
圖8.dPCRCNV結(jié)果CI統(tǒng)計區(qū)間
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信號采集：
d.
信號采集過程中熒光粉塵、交叉污染，都會影響正常陰陽單元的判定，可通過在超凈臺操作有效降低前者的影響。后者往往對反應(yīng)單元的信噪比和單元間隔絕性有比較高的要求（如圖9），原理上微滴法很難控制微滴間干擾和液滴融合等問題，相較而言以芯片為反應(yīng)單元的數(shù)字PCR設(shè)備可以通過提高微孔工藝進(jìn)而解決此類問題。
圖9.孔之間應(yīng)有較大間隔，可以避開孔之間的交叉干擾，獲取更好的信噪比
（來源：羅氏診斷整理）
1D,2D結(jié)果中閾值的判讀也是影響最終結(jié)果的重要因素。由于試劑耗材組分、非特異性擴(kuò)增、探針引物二聚體等現(xiàn)象，導(dǎo)致背景噪音更為明顯，導(dǎo)致陰陽性孔間閾值難以劃分（如圖10）。優(yōu)化探針引物序列和配比、摸索合適的退火溫度、配合低背景芯片耗材（如圖11），同時結(jié)合硬件，比如結(jié)合使用高分辨率的光學(xué)檢測系統(tǒng)、高性能的PCR溫控系統(tǒng)可以有效提高信噪比，使閾值能夠準(zhǔn)確劃分。
圖10.1D圖陰性（藍(lán)色）與陽性（紅色）信號應(yīng)考察聚集度、信噪比、有無Rain等指標(biāo)
（來源：羅氏診斷整理）
圖11.芯片標(biāo)準(zhǔn)化的六邊形微腔
（來源：羅氏診斷整理）
以上就是數(shù)字PCR實驗流程常見的幾類問題和參考性的解決方案。我們在實驗中面對小分子樣本的隨機(jī)性，雖然無法超越不確定性極限達(dá)到確定，但通過細(xì)節(jié)把控和數(shù)據(jù)優(yōu)化，使我們可以通過高效的方案進(jìn)行實驗。
*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日
活動最終解釋權(quán)歸羅氏診斷生命科學(xué)所有。
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