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競爭法ELISA及其操作細(xì)節(jié)
閱讀：5158 發(fā)布時間：2021-9-8競爭法ELISA
“這個競爭法ELISA試劑盒總是做不好，數(shù)據(jù)好奇怪啊" 讓小編帶你走進(jìn)競爭法ELISA的小世界，揭秘做好競爭法ELISA檢測的小技巧和小細(xì)節(jié)。
小概念：
直接競爭法：將捕獲抗體固化在微孔板上，加入酶標(biāo)記抗原與待測樣本，若待測樣本中含有抗原，則與酶標(biāo)記抗原競爭結(jié)合孔板上的捕獲抗體。
間接競爭法：將捕獲抗原固化在微孔板上，加入酶標(biāo)記抗體與待測樣本，若待測樣本中含有抗原，則與孔板上的固化捕獲抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)記抗體。
競爭法ELISA檢測目標(biāo)：
抗體、抗原、蛋白、代謝產(chǎn)物
試劑盒的關(guān)鍵：（以直接競爭法為例）
捕獲目的蛋白的抗體
使試劑顯色的酶標(biāo)記抗原
ELISA孔板設(shè)計
ELISA孔板經(jīng)特殊設(shè)計，可以使各種蛋白及抗體高親和地附著在孔板內(nèi)。
競爭法ELISA是如何實(shí)現(xiàn)檢測的？
（以直接競爭法為例）
首先，微孔板預(yù)包被了捕獲抗體，并用BSA對微孔板進(jìn)行封閉處理，這樣做的目的是避免非特異性結(jié)合的產(chǎn)生，降低背景信號，增加特異性。
將樣品與試劑盒中的酶標(biāo)抗原充分預(yù)混合后，將混合物加入到微孔板中。酶標(biāo)抗原與樣品中的目的蛋白可以和捕獲抗體上同一個表位競爭性結(jié)合。（*這一步不同于其他方法）
經(jīng)過抗原和抗體的充分結(jié)合后，樣品中的目的蛋白以及試劑盒的部分酶標(biāo)抗原分別與固定在微孔板上的捕獲抗體結(jié)合，再通過清洗，洗滌走未結(jié)合的酶標(biāo)抗原和其他非目的蛋白，最后通過TMB進(jìn)行顯色。
當(dāng)樣品目的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶標(biāo)抗原含量時，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對較少，從而顯色信號弱（上圖左。）
當(dāng)樣品目的蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于酶標(biāo)抗原含量時，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對較多，從而顯色信號強(qiáng)（上圖右。）
因此檢測蛋白的含量多少與最終檢測信號值的強(qiáng)弱成反比。
競爭法ELISA的小細(xì)節(jié)
上個板塊，小編帶你們回顧了下競爭法ELISA的基本檢測原理，可以看出保證混合物（樣品+酶結(jié)合蛋白）與捕獲蛋白的充分反應(yīng)和結(jié)合是競爭法ELISA成功的關(guān)鍵。接下來，我們講一下實(shí)際操作中影響該環(huán)節(jié)的一些小細(xì)節(jié)。
實(shí)驗(yàn)溫度
實(shí)驗(yàn)溫度會影響微觀分子運(yùn)動的速率以及活化分子比率。溫度越高，微觀分子運(yùn)動增加，分子碰撞次數(shù)增加，活化分子比率增加。
同樣對于酶參與的催化反應(yīng)，過高或過低溫度都會影響酶的活性，從而影響反應(yīng)效率。
建議：參看產(chǎn)品使用說明，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明推薦溫度操作實(shí)驗(yàn)。
振蕩器的選擇與參數(shù)設(shè)定
競爭法ELISA離不開振蕩器的使用。
為什么振蕩器對實(shí)驗(yàn)如此重要呢？讓小編帶你走進(jìn)微觀世界的ELISA檢測（如上圖）。
從微觀的角度上，固相與液相之間會形成一層具有邊界效應(yīng)的界面，稱為邊界層，這個層面在一定程度上會影響抗原與抗體的充分結(jié)合。而振蕩器就能夠起到打破邊界層的阻礙效果，輔助抗原抗體更加充分結(jié)合。
通常情況下，大家常常關(guān)注到振蕩器的轉(zhuǎn)速，也就是500 rpm，然而另一個重要細(xì)節(jié)往往會被忽略——軌道直徑。
軌道直徑 ，又稱振幅，也就是托盤振蕩一圈時的直徑。根據(jù)天津阿斯?fàn)柹锟萍加邢薰镜膶?shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)振蕩器振速或振幅不足時，可能會造成整體OD值偏低的結(jié)果。當(dāng)振幅過大時，可能會造成微孔板內(nèi)液體飛濺、樣品孔污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
英國RSR開發(fā)總部使用的是德國IKA MTS 2/4振蕩器，如下圖所示。
該產(chǎn)品軌道直徑3mm，支持1-4個ELISA板同時振蕩，且能夠確保微孔板在振蕩時既不會松脫也不會有液體飛濺。
經(jīng)過RSR TJ的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，美國精騏振蕩器HYQ-3111同樣滿足RSR旗下競爭法ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)需求。（轉(zhuǎn)速200~3000rpm，振幅4.5mm）。當(dāng)您不確定實(shí)驗(yàn)室的振蕩器是否滿足ELISA實(shí)驗(yàn)規(guī)定時，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性。
小小振蕩器，卻藏有這么多不可忽略的小細(xì)節(jié)，進(jìn)而影響到最終實(shí)驗(yàn)的成敗。因此當(dāng)我們準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)的時候，認(rèn)真遵循說明書，如果能對實(shí)驗(yàn)的基本原理了解透徹，可以更加保證結(jié)果的準(zhǔn)確。