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技術(shù)文章

橋式ELISA法檢測成人糖尿病患者血清中ZnT8抗體

閱讀:2457          發(fā)布時間:2018-5-24

鋅轉(zhuǎn)運體8是β細胞*的跨膜蛋白,其位于胰島素分泌顆粒中,參考膜內(nèi)外鋅離子濃度的調(diào)節(jié)。因此鋅轉(zhuǎn)運體8也成為了1型糖尿病重要的自身抗原。

一、前言

鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體主要同鋅轉(zhuǎn)運體8 C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合,人群基因的多態(tài)性使第325氨基酸的密碼子可表達出三種蛋白質(zhì):精氨酸(R)325,色氨酸(W)325,少數(shù)情況下表達為谷氨酰胺(Q)325。鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體可以特異性識別R325、W325類,或識別非特異性殘基325,極少數(shù)情況下可與Q型結(jié)合。RSR公司鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體檢測試劑盒可定量檢測R325、W325以及非特異性殘基325型自身抗體。檢測鋅轉(zhuǎn)運體8抗體可與檢測谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細胞抗原2抗體等項目形成互補。相比于檢測單種抗體,同時檢測多項抗體陽性更具診斷價值。

二、料與方法

1.材料

血清樣本,來源:

1)94例1型糖尿病患者(T1DM);

2)51例成人隱匿型自免糖尿病患者(LADY);

3)59例2型糖尿病患者(T2DM)包括28例初診斷及31例不同治療過程患者;

4)200名健康志愿者(HBD);

5)30例格雷夫斯氏病患者;

6)20例阿狄森氏病患者。

2.方法

1)橋式ELISA法(RSR Ltd)

2)免疫沉淀分析法(immunoprecipitation assay,IPA):35S標記ZnT8抗原,抗原類型分W325/R325二聚體,W325,R325,P325單體。

3)GADAb ELISA試劑盒、IA-2Ab ELISA試劑盒、IAA放免試劑盒,試劑盒來自RSR Ltd。

三、研究結(jié)果

1. 精密度分析

用兩個質(zhì)控樣品(抗體濃度為50 ± 15 u/mL 和 210 ±50 u/mL)進行批間(n=6)和批內(nèi)精密度(n=10)分析,中濃度ZnT8Ab批間和批內(nèi)精密度分別為7.1%和1.7%,高濃度ZnT8Ab批間和批內(nèi)精密度分別為8.5%和2.7%。

2. ZnT8抗體陽性檢測率

用ELISA方法,ZnT8Ab陽性檢出率分別為:T1DM 54.3%,LADA 31.4%,T2DM 1.7%。ZnT8Ab ELISA試劑盒檢測TIDM及健康人血清樣本,通過ROC分析,靈敏性為54%,特異性99%(cut-off 15U/ml),AUC為0.8(95%置信區(qū)間,0.74-0.86)。

3. 比較ELISA與IPA方法檢測ZnT8

抗體

T1DM患者中,ELISA為54.3%(51/94),IPA為50%(47/94);LADA患者中,ELISA為31.4%(16/51),IPA為29.4%(15/51); T2DM患者中,ELISA為1.7%(1/59),IPA為3.4%(2/59);健康對照(HBD)中,特異性分別為ELISA 99%,IPA為96.5%。

4. 線性分析

線性分析中,陽性質(zhì)控及血清樣本用陰性對照品進行了1:2, 1:5, 1:10, 1:20的稀釋。所有樣品,ELISA檢測結(jié)果與IPA(W325/R325二聚體)檢測結(jié)果具有很好的一致性(r=0.856, k=0.889, n=204)。在1型糖尿病患者和LADA患者中的一致性(r=0.837, k=0.875, n=145)(圖4)。


5. 用多種不同的抗體檢測試劑盒進行分析

T1DM患者中,對多種抗體檢測,陽性率分別為:ZnT8Ab 51/94(54.3%),GAD Ab 70/94(74.5%),IA-2 Ab 42/94(44.7%),IAA 24/94(25.5%)。至少一種方法檢測出陽性概率統(tǒng)計為85.1%,僅ZnT8 Ab檢測陽性概率為4.3%,ZnT8Ab使陽性檢出率從80.9%上升至85.1%;

LADA患者中,GAD Ab全陽性,ZnT8 Ab 16/51(31.4%),IA-2 Ab 12/51(23.5%), IAA 6/51(11.8%);

28例新診斷T2DM患者中,GAD Ab檢測只有1例陽性。在所有T2DM患者中(28例新診斷,31例不同時期),檢出陽性患者數(shù)分別為ZnT8 Ab 1/59(1.7%),GAD Ab 10/59(16.9%), IA-2 Ab 2/59(3.4%),IAA 2/59(3.4%),至少一種抗體陽性統(tǒng)計結(jié)果為13/59(22%),沒有ZnT8Ab單獨呈陽性檢出者。

30例格雷夫斯氏病患者ZnT8 Ab ELISA檢測無陽性,20例阿狄森氏病患者中ZnT8Ab ELISA檢測2例陽性(23.6 和48.2 U/mL),對陽性(23.6 U/ mL)血清用GADAb及IAA檢測也成陽性,IA-2Ab呈陰性。另一例ZnT8 Ab ELISA檢測陽性(48.2 U/mL)因血清不足未能檢測。

四、結(jié)論

橋式ELISA是一種簡單且可重復的檢測血清ZnT8Ab的方法,可提高成人1型糖尿病的抗體陽性檢出率。
 

參考文獻:Dunseath G, Ananieva-Jordanova R, Coles R, et al. Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 447: 90-95.

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