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橋式ELISA法檢測成人糖尿病患者血清中ZnT8抗體
閱讀：2457 發(fā)布時間：2018-5-24鋅轉(zhuǎn)運體8是β細胞*的跨膜蛋白，其位于胰島素分泌顆粒中，參考膜內(nèi)外鋅離子濃度的調(diào)節(jié)。因此鋅轉(zhuǎn)運體8也成為了1型糖尿病重要的自身抗原。
一、前言
鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體主要同鋅轉(zhuǎn)運體8 C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，人群基因的多態(tài)性使第325氨基酸的密碼子可表達出三種蛋白質(zhì)：精氨酸（R）325，色氨酸（W）325，少數(shù)情況下表達為谷氨酰胺（Q）325。鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體可以特異性識別R325、W325類，或識別非特異性殘基325，極少數(shù)情況下可與Q型結(jié)合。RSR公司鋅轉(zhuǎn)運體8自身抗體檢測試劑盒可定量檢測R325、W325以及非特異性殘基325型自身抗體。檢測鋅轉(zhuǎn)運體8抗體可與檢測谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細胞抗原2抗體等項目形成互補。相比于檢測單種抗體，同時檢測多項抗體陽性更具診斷價值。
二、材料與方法
1.材料
血清樣本，來源：
1）94例1型糖尿病患者（T1DM）；
2）51例成人隱匿型自免糖尿病患者（LADY）；
3）59例2型糖尿病患者（T2DM）包括28例初診斷及31例不同治療過程患者；
4）200名健康志愿者（HBD）；
5）30例格雷夫斯氏病患者；
6）20例阿狄森氏病患者。
2.方法
1）橋式ELISA法（RSR Ltd）
2）免疫沉淀分析法（immunoprecipitation assay，IPA）：35S標記ZnT8抗原，抗原類型分W325/R325二聚體，W325，R325，P325單體。
3）GADAb ELISA試劑盒、IA-2Ab ELISA試劑盒、IAA放免試劑盒，試劑盒來自RSR Ltd。
三、研究結(jié)果
1. 精密度分析
用兩個質(zhì)控樣品（抗體濃度為50 ± 15 u/mL 和 210 ±50 u/mL）進行批間（n=6）和批內(nèi)精密度(n=10)分析，中濃度ZnT8Ab批間和批內(nèi)精密度分別為7.1%和1.7%，高濃度ZnT8Ab批間和批內(nèi)精密度分別為8.5%和2.7%。
2. ZnT8抗體陽性檢測率
用ELISA方法，ZnT8Ab陽性檢出率分別為：T1DM 54.3%，LADA 31.4%，T2DM 1.7%。ZnT8Ab ELISA試劑盒檢測TIDM及健康人血清樣本，通過ROC分析，靈敏性為54%，特異性99%（cut-off 15U/ml），AUC為0.8（95%置信區(qū)間，0.74-0.86）。
3. 比較ELISA與IPA方法檢測ZnT8
抗體
T1DM患者中，ELISA為54.3%（51/94），IPA為50%（47/94）；LADA患者中，ELISA為31.4%（16/51），IPA為29.4%（15/51）； T2DM患者中，ELISA為1.7%（1/59），IPA為3.4%（2/59）；健康對照（HBD）中，特異性分別為ELISA 99%，IPA為96.5%。
4. 線性分析
線性分析中，陽性質(zhì)控及血清樣本用陰性對照品進行了1:2, 1:5, 1:10, 1:20的稀釋。所有樣品，ELISA檢測結(jié)果與IPA（W325/R325二聚體）檢測結(jié)果具有很好的一致性（r=0.856, k=0.889, n=204）。在1型糖尿病患者和LADA患者中的一致性（r=0.837, k=0.875, n=145）（圖4）。
5. 用多種不同的抗體檢測試劑盒進行分析
T1DM患者中，對多種抗體檢測，陽性率分別為：ZnT8Ab 51/94（54.3%），GAD Ab 70/94(74.5%)，IA-2 Ab 42/94(44.7%)，IAA 24/94(25.5%)。至少一種方法檢測出陽性概率統(tǒng)計為85.1%，僅ZnT8 Ab檢測陽性概率為4.3%，ZnT8Ab使陽性檢出率從80.9%上升至85.1%；
LADA患者中，GAD Ab全陽性，ZnT8 Ab 16/51(31.4%)，IA-2 Ab 12/51(23.5%)， IAA 6/51(11.8%)；
28例新診斷T2DM患者中，GAD Ab檢測只有1例陽性。在所有T2DM患者中（28例新診斷，31例不同時期），檢出陽性患者數(shù)分別為ZnT8 Ab 1/59(1.7%)，GAD Ab 10/59(16.9%)， IA-2 Ab 2/59(3.4%)，IAA 2/59(3.4%)，至少一種抗體陽性統(tǒng)計結(jié)果為13/59（22%），沒有ZnT8Ab單獨呈陽性檢出者。
30例格雷夫斯氏病患者ZnT8 Ab ELISA檢測無陽性，20例阿狄森氏病患者中ZnT8Ab ELISA檢測2例陽性(23.6 和48.2 U/mL)，對陽性（23.6 U/ mL）血清用GADAb及IAA檢測也成陽性，IA-2Ab呈陰性。另一例ZnT8 Ab ELISA檢測陽性（48.2 U/mL）因血清不足未能檢測。
四、結(jié)論
橋式ELISA是一種簡單且可重復的檢測血清ZnT8Ab的方法，可提高成人1型糖尿病的抗體陽性檢出率。
參考文獻：Dunseath G, Ananieva-Jordanova R, Coles R, et al. Bridging-type enzyme-linked immunoassay for zinc transporter 8 autoantibody measurements in adult patients with diabetes mellitus[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 447: 90-95.