簡(jiǎn)介

大多數(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)工作是在二維 (2D) 模式下進(jìn)行的，這樣細(xì)胞可以在平面上生長(zhǎng)。然而，在 2D 中培養(yǎng)細(xì)胞以篩選藥物可提供體內(nèi)發(fā)生情況的圖像有限，因?yàn)樗鼰o(wú)法捕獲來(lái)自細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 的信號(hào)如何影響細(xì)胞對(duì)不同化合物的反應(yīng)。相反，腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞球可以在微孔板中培養(yǎng)，并在三維 （3D） 基質(zhì)中成像，以便在更接近模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的模型中篩選藥物。

在這里，我們將新型光交聯(lián) 3D 細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)、Symphony® 儀器和 VersaGel® ECM 水凝膠與 ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)配對(duì)，以展示適用于高通量篩選的 3D 檢測(cè)。VersaGel 是一種可光交聯(lián)的 ECM 水凝膠，用于 3D 體外和離體測(cè)定。這種可調(diào)諧的 ECM 水凝膠可概括人體生理學(xué)并支持多種細(xì)胞類型。腫瘤細(xì)胞懸液或細(xì)胞球可包封在 VersaGel 中。一旦細(xì)胞模型建立，可添加化合物，隨后進(jìn)行細(xì)胞染色，隨后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行成像。

為了進(jìn)一步提高通量，MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件允許在僅觀察到 1-4 個(gè)細(xì)胞球/孔的實(shí)驗(yàn)中使用 QuickID。使用 QuickID，可在低放大倍率下快速掃描整個(gè)板，然后僅在更高放大倍率和多個(gè) z 平面下對(duì)包含細(xì)胞球的孔或視野進(jìn)行重新成像。我們展示

經(jīng)化療藥物處理的三種不同 VersaGel 硬度中不同腫瘤細(xì)胞系的優(yōu)化細(xì)胞球生長(zhǎng)的結(jié)果，以說(shuō)明 Symphony 和 VersaGel 如何與 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)搭配使用是一個(gè)簡(jiǎn)單的工作流程，可為藥物篩選提供強(qiáng)大的解決方案（圖 1）。

圖 1：Symphony 和 VersaGel 3D 培養(yǎng)系統(tǒng)隨后使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)成像，是一種生理學(xué)相關(guān)的方法，適用于高通量藥物篩選。

優(yōu)勢(shì)

使用 Symphony 和 VersaGel 3D 平臺(tái)篩選 3D 細(xì)胞球中的藥物

使用自動(dòng) QuickID 靶向成像將數(shù)據(jù)采集速度

圖像生成量比標(biāo)準(zhǔn)采集少 20X

渲染 3D 對(duì)象或 2D 投影以進(jìn)行分割

Materials

•       已證實(shí)的腫瘤細(xì)胞系 - U2OS, MCF-7, HCT-116

•       玻璃底，96 孔微孔板（Greiner）

•       EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 檢測(cè)試劑盒（Molecular Devices，PN R8348）

•       EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)（Molecular Devices，PN R8340）

•       VersaGel ECM 水凝膠 （Cypre， Inc.）

•       Symphony 儀器 （Cypre， Inc.）

•       ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)與 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件 （Molecular Devices）

3D VersaGel 細(xì)胞球生長(zhǎng)和成像方法 

Symphony 和 VersaGel 3D 培養(yǎng)平臺(tái)使用一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，其中液體 VersaGel 最初以 1：1 的體積比例與培養(yǎng)基中的細(xì)胞或細(xì)胞球混合。接下來(lái)，VersaGel/細(xì)胞球混合物被 Symphony 交聯(lián)，使整個(gè)板暴露于低強(qiáng)度藍(lán)光下 60 秒，以使孔內(nèi)的凝膠聚合。然后可以使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行成像。由于 VersaGel 是微孔的，細(xì)胞可以用小分子化合物或抗體處理，并在包封在基質(zhì)中后染色并固定甲醛。基質(zhì)保持附著在平板上，可在 4°C 下儲(chǔ)存，而不影響固定后的結(jié)構(gòu)。

使用 QuickID 靶向成像提高成像效率

QuickID 通過(guò)靶向 96 孔板中成像的細(xì)胞球簡(jiǎn)化成像。首先使用 2X 物鏡在一個(gè)視野中捕獲整個(gè)孔。識(shí)別目標(biāo)對(duì)象，并使用其 X 和 Y 坐標(biāo)自動(dòng)獲得多個(gè) z 平面上三個(gè)波長(zhǎng)的更高放大倍數(shù)的圖像。該過(guò)程比高倍放大下的手動(dòng)細(xì)胞球成像快 10X，產(chǎn)生的高分辨率圖像需要存儲(chǔ)的時(shí)間減少了 20X（圖 2）。

圖 2. QuickID 用于簡(jiǎn)化細(xì)胞球圖像的采集。在低放大倍率下采集的用于在一個(gè)視野中查看整個(gè)孔的圖像被用于識(shí)別對(duì)象，以便使用跨多個(gè) z 平面的三個(gè)波長(zhǎng)在更高的放大倍率下自動(dòng)重新成像。

優(yōu)化生長(zhǎng)和染色條件

為了優(yōu)化源自 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞球的條件，首先在超低附著微孔板中培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞球，方法是在圓底 96 孔板中接種 1，500 個(gè)細(xì)胞/孔，并培養(yǎng) 3-5 天。然后將培養(yǎng)基中的細(xì)胞球與三種不同的 VersaGel 制劑以 1：1 的體積比組合，并將 50 uL/孔轉(zhuǎn)移至玻璃底 96 孔微孔板。使用 Symphony 儀器使凝膠聚合，并且在用 Hoechst 和 Phalloidin-AlexaFluor 546 固定和染色之前，使囊封的細(xì)胞球再生長(zhǎng)三天。MCF-7 細(xì)胞球的共聚焦圖像顯示，它們?cè)趫?jiān)硬的 VersaGel 中通常保持更緊湊，并且在軟制劑中生長(zhǎng)的球形更少（圖 3）。

圖 3. MCF-7 細(xì)胞球在三種 VersaGel 硬度下培養(yǎng)。 細(xì)胞球形狀和大小略有不同，但選擇標(biāo)準(zhǔn)凝膠硬度進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

使用 EarlyTox 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞球的影響

EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞測(cè)定用于確定 U2OS 骨癌細(xì)胞球的活性。在 VersaGel 中交聯(lián)活細(xì)胞、預(yù)形成的細(xì)胞球后，它們?cè)偕L(zhǎng)兩天，然后用化合物處理 48 小時(shí)。用通常用于 2D 細(xì)胞培養(yǎng)的兩倍染料濃度對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行染色，并孵育兩倍長(zhǎng)的時(shí)間。使用 QuickID 識(shí)別細(xì)胞球，并測(cè)量活染（綠色）與死染（紅色）相比的存在（圖 4A）。結(jié)果（圖 4B）確認(rèn)使用 Symphony 和 VersaGel 平臺(tái)與預(yù)成形細(xì)胞球兼容 EarlyToxLive/Dead 檢測(cè)。

圖 4. EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)與 VersaGel 中的細(xì)胞球兼容。A） 用三種不同的化合物處理預(yù)形成的 U2OS 細(xì)胞球 48 小時(shí)。B） 存在活染（綠色）和死染（紅色）時(shí)測(cè)得的毒性。腫瘤細(xì)胞球?qū)γ糠N藥物化合物的反應(yīng)與預(yù)期一致。

然后，我們使用 EarlyTox Caspase 3/7 檢測(cè)與在標(biāo)準(zhǔn) VersaGel 中培養(yǎng)的預(yù)成型 HCT-116 結(jié)腸癌細(xì)胞球，如前所述。用三種不同的化合物處理細(xì)胞球 48 小時(shí)，并使用 QuickID 識(shí)別和測(cè)定凋亡細(xì)胞核的存在（綠色）
（圖 5）。分析結(jié)果顯示對(duì)化合物的預(yù)期反應(yīng)，證實(shí)了 EarlyToxCaspase 3/7 NucView 488 檢測(cè)與 Symphony 和 VersaGel 平臺(tái)的兼容性。

圖 5. EarlyTox 凋亡檢測(cè)與 VersaGel 兼容。 用三種不同的化合物處理預(yù)形成的 HCT-116 細(xì)胞球 48 小時(shí)，并通過(guò)凋亡核（綠色）的存在來(lái)測(cè)定細(xì)胞毒性。

2D 投影分析得出的結(jié)論與 3D 分析相同
MetaXpress 軟件用于比較 2D 和 3D 分析之間 HCT-116 細(xì)胞球中的凋亡。將細(xì)胞球懸浮在 VersaGel 中，并采集多個(gè) Z 平面以收集跨越細(xì)胞球深度的圖像。所有圖像都被保存以構(gòu)建 3D 對(duì)象，并且還用于創(chuàng)建單個(gè) 2D 最佳對(duì)焦投影（圖 6A）。

使用EarlyTox Caspase 3/7 NucView 488 檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞凋亡，并將 2D 投影分析與 3D 對(duì)象分析進(jìn)行比較。圖形分析表明，使用 2D 和 3D 分析，依托泊苷處理可增加 HCT-116 細(xì)胞的凋亡（圖 6B）。

圖 6. 2D 和 3D 分析的比較。左圖是針對(duì)凋亡標(biāo)記（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）染色的最佳聚焦圖像的疊加圖。中心圖像是使用*家藍(lán)分割的綠色凋亡細(xì)胞分析 2D 圖像時(shí)產(chǎn)生的分割掩膜。右圖是 3D 對(duì)象的分割掩膜，Hoechst 細(xì)胞核呈單色偽彩，NucView 488 陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色。B. NucView 488 強(qiáng)度的測(cè)定表明，經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞凋亡增加。3D 分析顯示，使用 2D 投影分析時(shí)，經(jīng)處理細(xì)胞中的細(xì)胞球體積減少并不明顯。

結(jié)論

該平臺(tái)用途廣泛，是腫瘤腫瘤學(xué)研究的理想選擇。單個(gè)或大體積預(yù)形成的細(xì)胞球可轉(zhuǎn)移至 VersaGel 中，細(xì)胞也可直接在微孔板的 VersaGel 中培養(yǎng)。VersaGel 剛度可進(jìn)行調(diào)整，以實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞球培養(yǎng)。

QuickID 簡(jiǎn)化了該過(guò)程，因此圖像的采集時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)成像少得多，生成的圖像也少得多，從而減少了存儲(chǔ)需求。此外，MetaXpress 軟件還簡(jiǎn)化了 3D 細(xì)胞分析工作流程，能夠覆蓋細(xì)胞圖像、構(gòu)建 3D 對(duì)象并將圖像折疊成單個(gè) 2D 投影進(jìn)行分析，然后分割陽(yáng)性細(xì)胞。

該實(shí)驗(yàn)表明，將 Symphony 和 Versagel 3D 檢測(cè)與 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)配對(duì)是一種多功能、強(qiáng)大的解決方案，可將藥物篩選提升到一個(gè)新的水平。