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基于島津AIRsight紅外拉曼顯微鏡，開展原位、多模態(tài)單細胞微納塑料暴露觀測及毒理效應(yīng)的研究
摘要
微納米塑料是指粒徑介于納米級至5mm之間的塑料碎片和顆粒。近年來，以微納米塑料為代表的新型污染物受到的國際社會關(guān)注度持續(xù)提升，《環(huán)境署2014年年鑒》和《評估塑料的價值》報告指出，塑料污染威脅到了海洋生物的生存以及旅游業(yè)、漁業(yè)和商業(yè)的發(fā)展【1】，引起了人們對微納米塑料的廣泛關(guān)注，已經(jīng)有大量研究報道表明，微納米塑料對海洋生態(tài)以及生物和人類健康存在持久的、確定和不確定的危害。隨著微納米塑料污染關(guān)注度的提升和其生態(tài)效應(yīng)研究的深入，對其生物毒理學(xué)效應(yīng)影響的評價研究也逐漸成為業(yè)界研究熱點和難點之一。
當前，全球?qū)ξ⒓{米塑料的毒理作用機制的研究還不夠充分，尚缺乏成熟的實驗方法和研究手段。盡管如此，已有的初步研究結(jié)果暗示【2】，微納米塑料可能對生物體的代謝系統(tǒng)可產(chǎn)生多方面負面影響，這可能會增加代謝綜合征的風險。鑒于塑料產(chǎn)品的廣泛使用，微納米塑料在環(huán)境中的濃度迅速上升，并在人體組織中積累，因此，評估其對健康的潛在影響以及深入研究其毒理機制變得尤為關(guān)鍵和緊迫。
本工作通過使用島津紅外拉曼顯微鏡（AIRsight）的顯微紅外和顯微拉曼功能，原位、多模態(tài)地研究了單個細胞在受到PS微納塑料暴露后的表征（顯微拉曼）及毒理行為（顯微紅外）：通過顯微拉曼，原位表征單細胞吞噬的超小尺寸微納塑料的分布特征；通過使用顯微紅外，原位表征同一單細胞在暴露微納塑料后，蛋白與其的結(jié)合行為，進而對具有代表性的納米級、亞微米級和微米級的微納米塑料對生物體免疫應(yīng)激效應(yīng)的毒理學(xué)影響進行評價。
1、顯微拉曼光譜表征細胞內(nèi)微納塑料
使用AIRsight的顯微拉曼功能，分別對500nm-1μm微納塑料染毒暴露的單個巨噬細胞及未染毒暴露的單個巨噬細胞進行測試，結(jié)果如圖2所示。圖中紅色線圈及對應(yīng)紅色譜線為未染毒暴露的單個巨噬細胞，黑線圈區(qū)域及對應(yīng)黑色譜線為微納塑料暴露染毒的單個巨噬細胞，可從其拉曼譜圖的標藍區(qū)域中清晰看到PS微塑料的特征峰：1002cm-1為苯環(huán)呼吸振動，1030cm-1為苯環(huán)內(nèi)C原子間對稱伸縮振動，1604cm-1為苯環(huán)內(nèi)C原子間非對稱伸縮振動，3053cm-1為C-H鍵伸縮振動。該結(jié)果表明，使用AIRsight顯微拉曼功能，可清晰實現(xiàn)對細胞吞噬的微量亞微米/納米級塑料進行有效觀測和表征。
圖2 使用顯微拉曼光譜表征單個巨噬細胞吞噬微納塑料
2顯微紅外光譜表征單細胞蛋白與微納塑料相互作用
圖3 使用顯微紅外光譜表征單個巨噬細胞蛋白與微納塑料的相互作用
借助于AIRsight的紅外與拉曼雙光路耦合設(shè)計，通過軟件端一鍵切換，即可直接實現(xiàn)對同一單細胞的原位顯微紅外功能，分別對單個微納塑料染毒暴露的巨噬細胞及未染毒暴露的巨噬細胞進行測試，結(jié)果如圖3所示。圖中紅色線圈及對應(yīng)紅色譜線為未染毒暴露的單個巨噬細胞，黑線圈區(qū)域及對應(yīng)黑色譜線為微納塑料暴露染毒的單個巨噬細胞。從圖中標藍區(qū)域可清晰看到兩組紅外特征吸收峰，其中1600-1700 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺I帶特征吸收峰（代表蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)），1500-1600 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺II帶特征吸收峰（代表蛋白質(zhì)構(gòu)象）。
圖4 單個巨噬細胞蛋白與微納塑料的相互作用：酰胺I帶和酰胺II帶發(fā)生波數(shù)位移
進而對圖4中的酰胺I帶和酰胺II帶進行區(qū)域放大，如圖4所示：相比較于未染毒暴露的單個巨噬細胞（紅線），微納塑料暴露染毒的單個巨噬細胞（黑線）在兩組特征吸收峰上均向高波數(shù)發(fā)生了位移，位移量分別為9 cm-1和5 cm-1，表明受到微納塑料暴露影響，單個巨噬細胞中的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（酰胺I帶）和構(gòu)象（酰胺II帶）均受到了一定程度的影響，進而影響到該細胞的正常功能。在此基礎(chǔ)上，對10組對應(yīng)的微納塑料暴露染毒和未暴露染毒的巨噬細胞進行波數(shù)位移統(tǒng)計，結(jié)果如圖4中柱狀圖所示：相比較于未染毒暴露的單個巨噬細胞（紫色柱狀圖），經(jīng)微納塑料暴露染毒的單個巨噬細胞（藍色柱狀圖）在酰胺I帶和酰胺II帶均發(fā)生了一定程度的波數(shù)位移，證明該結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明經(jīng)巨噬細胞吞噬后，微納塑料確實與細胞蛋白具有一定程度的相互作用，即微納塑料對巨噬細胞具有影響其正常功能的毒理學(xué)效應(yīng)。
結(jié)論
本工作通過使用島津紅外拉曼顯微鏡（AIRsight）的顯微紅外和顯微拉曼功能，原位、多模態(tài)地研究了單個巨噬細胞在受到PS微納塑料暴露后的表征（顯微拉曼）及毒理行為（顯微紅外）：通過顯微拉曼，原位觀測了單細胞吞噬的超小尺寸微納塑料的分布特征；通過使用顯微紅外，原位表征同一單細胞在暴露微納塑料后，蛋白與其的結(jié)合行為，進而對具有代表性的亞微米級的微納米塑料對生物體免疫應(yīng)激效應(yīng)的毒理學(xué)影響進行評價，為以微塑料為代表的新污染物毒理學(xué)研究提供新的方法和思路。
參考文獻：
【1】環(huán)境署2014年年鑒．聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署．2014年6月23日
【2】翁丹，黃舒嫻，張丹陽．微納米塑料對代謝的影響及其分子機制的研究進展[J/OL]．海南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版).
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