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神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

閱讀:2006        發(fā)布時(shí)間:2018/6/26
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一、  神經(jīng)干細(xì)胞的分離和傳代

無(wú)菌條件下取新生SD大鼠(出生48h內(nèi))腦組織,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖顯微鏡下剝離腦膜,準(zhǔn)確分離海馬,用眼科剪將海馬剪碎后,再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無(wú)血清培養(yǎng)基,吸管吹打機(jī)械分離制作單細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104~5個(gè)/ml,置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入細(xì)胞懸液500μl。待神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作單細(xì)胞懸液,仍以5×104個(gè)/ml的細(xì)胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每孔加入細(xì)胞懸液500μl。此后每7d機(jī)械分離克隆傳代1次,方法同前。

 

二、BrdU標(biāo)記

將BrdU溶于無(wú)血清培養(yǎng)基,過(guò)濾除菌后加入神經(jīng)球形成后再次機(jī)械分離克隆制作的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L),培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球形成后,將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中,貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

 

三、  經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中,并加入有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12),一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色,另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng),觀察其生長(zhǎng)分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

 

四、  條件培養(yǎng)液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織,加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min,離心獲得上清液,過(guò)濾除菌后,加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。

 

五、  經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM/F12)中對(duì)照貼壁培養(yǎng),7d后均行ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

 

六、  免疫細(xì)胞化學(xué)染色

培養(yǎng)細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min后,PBS充分漂洗,然后按ABC法分別行鼠抗Nestin,鼠抗Tuj1,兔抗GFAP,鼠抗Galc,鼠抗Brdu免疫細(xì)胞化學(xué)染色,用DAB和H2O2作為呈色劑,陽(yáng)性著色為棕黃色。具體方法為:

(1) 0.05M PBS漂洗 10min×3次

(2) 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min

(3) 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃,15min

(4) 0.05M PBS漂洗 10min×3次

(5) 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃,15min

(6) I抗(2%羊血清/0.05M PBS配) 4℃,48h

(7) 0.05M PBS漂洗 10min×3次

(8) II抗(2%羊血清/0.05M PBS配,1:200) 37 ℃,1.5h

(9) 0.05M PBS漂洗 10min×3次

(10) AB復(fù)合物(0.05M PBS配,1:100) 37 ℃,1.5h

(11) 0.05M PBS漂洗 10min×3次

(12) Tris-HCl緩沖液 37 ℃,15min

(13) DAB顯色 20min

(14) 蒸餾水漂洗 10min×3次

 

然后,為進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)元,將已作完ChAT免疫細(xì)胞化學(xué)染色的細(xì)胞用PBS終止顯色以及進(jìn)一步封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后, 仍用ABC法行Tuj1免疫細(xì)胞化學(xué)染色,用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞著色為藍(lán)黑色。

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