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中藥活性篩選與活性追蹤實驗
- DPPH法
| 實驗方法原理 | DPPH (2,2-二苯基-1-苦味基肼自由基，2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，其N上有一個游離電子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有大的吸收峰。加入抗氧化劑以后，DPPH捕捉一個電子與游離電子配對，紫色褪去，變?yōu)闊o色物質，在517 nm處的吸收消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關系。依此原理用分光光度計檢測DPPH自由基與試樣液反應后吸光值的變化，可檢定試樣提供氫原子、清除自由基抗氧化的能力。該法簡便易行，靈敏可靠，不失為篩選天然產(chǎn)物抗氧化劑的好方法之一。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 虎杖厚樸黃芩地榆前胡絞股藍麥冬葛根菊花白芍 |
| 試劑、試劑盒 | DPPH無水乙醇二甲基亞砜維生素C |
| 儀器、耗材 | 圓底燒瓶旋轉蒸發(fā)儀真空干燥機酶標板酶標儀 |
| 實驗步驟 | 1. 中藥材選擇：學生自選4種藥材 備選藥材：虎杖、厚樸、黃芩、地榆、前胡、絞股藍、麥冬、葛根、菊花、白芍 2. 中藥提取 分別將適當切碎的中藥材20 g放入250 ml圓底燒瓶中，各加入10倍量乙醇，回流提取1次，過濾后提取液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，并用真空干燥機干燥，備用。 3. 試劑的配制 DPPH溶液：稱取3.2 mg DPPH溶解于40 ml無水乙醇中，搖勻，備用。 提取物溶液：用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑配成濃度為5 mg/ml的溶液，備用。測定時稀釋成相應濃度。 維生素C溶液：DMSO作為溶劑配成濃度為0.5 mg/ml的溶劑，備用。 4. 活性藥材的篩選 取10 μL的樣品溶液放入酶標板中，再加入90 μL的DPPH溶液，以維生素C溶液做陽性對照，以DPPH溶液作為標準，樣品溶液為空白，室溫放置30 min后，酶標儀517 nm測定，利用以下公式計算各種樣品的清除率(k)，每個樣品測定2次(按下圖所示加樣)。
式中： Ae -- DPPH + 提取物混合溶液的吸光度 A0 -- 提取物溶液的吸光度 AD -- DPPH溶液的吸光度 AD0 -- DMSO+乙醇的吸光度 5. 活性藥材的活性成分追蹤 自主設計實驗，對通過上述活性篩選出的活性的藥材，進行提取和分離，對不同的流份進行進一步的活性追蹤評價。 |
