您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
12
大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的策略
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是發(fā)展zui早、目前zui為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等，是基礎(chǔ)研究和商業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的強(qiáng)大工具；但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如重組蛋白不穩(wěn)定，生物活性低，以包涵體形式表達(dá)。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率受多個因素的影響，在表達(dá)前對目的蛋白進(jìn)行分析和優(yōu)化，才能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)，主要包括如下幾個方面：
(1) 表達(dá)載體的選擇，表達(dá)載體啟動子的選擇很重要，啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與 RNA 聚合酶的親和力，從而影響了基因表達(dá)的水平，理想的啟動子應(yīng)該滿足：①具有強(qiáng)啟動性，能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄以保證目的蛋白的高產(chǎn)量；②可嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，在一定條件下開始誘導(dǎo)表達(dá)，可zui大限度降低細(xì)菌的代謝負(fù)荷和外源蛋白的毒性作用。其他如 SD 序列位置和轉(zhuǎn)錄終止子，也會影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。
(2) 密碼子優(yōu)化，含有大量稀有密碼子的基因在大腸桿菌中表達(dá)時，由于大腸桿菌缺乏某幾種 tRNA，會降低 mRNA 的翻譯效率和穩(wěn)定性，甚至?xí)斐煞g錯誤或提前中止。對目的基因進(jìn)行密碼子改造，可以提高 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率。
(3) 融合蛋白及分子伴侶，融合蛋白不僅可以作為親和標(biāo)簽利于下游純化操作，而且大分子融合蛋白還能增加蛋白的可溶性表達(dá)，如谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶 (GST),SUMO 蛋白，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），親水性強(qiáng)，有助于提高靶蛋白的可溶性和穩(wěn)定性；共表達(dá)分子伴侶可促進(jìn)重組蛋白的翻譯后折疊加工，提高蛋白可溶性和穩(wěn)定性。大腸桿菌系統(tǒng)中常用的有 GroEL 和 GroES 體系；熱休克蛋白 DnaK，DnaJ 和 GrpE 三元體系；Dsb 家族 (二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶)，能夠促進(jìn)二硫鍵的形成。
(4) 靶蛋白的定位表達(dá)，重組蛋白在大腸桿菌中合成后有 4 種定位, 即胞質(zhì)、周質(zhì)空間、內(nèi)膜或外膜和細(xì)胞外基質(zhì)中。利用信號肽將重組蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)或胞外培養(yǎng)基中, 細(xì)胞周質(zhì)空間的氧化環(huán)境利于二硫鍵的形成和硫基蛋白的正確折疊；周質(zhì)空間中的蛋白酶要比胞內(nèi)低很多，減少靶蛋白的降解；周質(zhì)空間中的蛋白數(shù)量也較胞內(nèi)少很多，利于靶蛋白的純化。
(5) 表達(dá)菌株的選擇，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。Rosetta2 系列補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC,GGA 及 CGG），提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平；K-12 衍生菌 Origami 2 系列，trxB 和 gor 雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)。Rosetta-gami™則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充 7 種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。
(6) 誘導(dǎo)條件，培養(yǎng)條件對重組蛋白的表達(dá)也很關(guān)鍵的，例如溫度，溫度較高時蛋白表達(dá)量高但容易形成包涵體，而溫度低時蛋白表達(dá)量低，但可以提高目的蛋白的可溶性；誘導(dǎo)物的濃度也同樣影響重組蛋白的表達(dá)效率，如低濃度 IPTG 誘導(dǎo)可以提高可溶蛋白的含量。另外培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，pH 和其它參數(shù)都可以影響蛋白酶的活性，分泌和表達(dá)水平。
在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白，表達(dá)前的分析非常重要，對目的基因和蛋白進(jìn)行具體分析，綜合考慮，選擇的表達(dá)體系和方法，才能實(shí)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)。