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多色流式實(shí)驗(yàn)熒光素的選擇
流式細(xì)胞儀已經(jīng)成為臨床醫(yī)生、免疫學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家*的工具，這項(xiàng)技術(shù)在不斷進(jìn)步。流式細(xì)胞儀的多參數(shù)細(xì)胞分析這一*的功能讓大多數(shù)細(xì)胞分析成為了可能。Coon首先提出了熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的目的蛋白技術(shù)，在20世紀(jì)80年代，細(xì)胞亞群僅僅通過檢測(cè)單一的細(xì)胞表面標(biāo)志物來確定，使用的單抗和熒光素很受限制?；虮磉_(dá)技術(shù)的誕生和新的單抗以及熒光素的獲得使更復(fù)雜的多參數(shù)分析成為可能。
1. 常用熒光素的種類及特性
1）. FITC（Fluorescein）又稱異硫氰酸熒光素，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；FITC 的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè)。
2). PE（R-Phycoerythrin）又稱藻紅蛋白，有R-PE和RD1的別稱，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；PE 的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為575nm，在流式細(xì)胞儀的FL2通道檢測(cè)。
3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed（TR）組合而成的Tandem熒光素；其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；PE-TR的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為 615nm，在流式細(xì)胞儀的FL3通道檢測(cè)；PE-TR標(biāo)記的抗體可用于毫瓦級(jí)激光器的小流式細(xì)胞儀，也適用于配備有全功率激光器的大流式分選儀。
4). PI（PropidiumIodide）又稱碘化丙啶，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；PI的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為617nm。在流式細(xì)胞儀的FL3通道檢測(cè)。
5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）又稱TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5組合而成的Tandem熒光素；其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；PE-Cy5 的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為670nm，在流式細(xì)胞儀上用FL3通道檢測(cè)；PE-Cy5 標(biāo)記的抗體可用于毫瓦級(jí)激光器的小流式細(xì)胞儀，也適用于配備有全功率激光器的大流式分選儀。
6). PerCP（Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex）多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；PerCP的zui大發(fā)射波長(zhǎng)為677nm。在流式細(xì)胞儀的FL3通道檢測(cè)。
7). APC（Allophycocyanin）又稱別藻藍(lán)蛋白，其標(biāo)記的抗體適用于配備氦氖激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的多色流式細(xì)胞儀；APCzui大發(fā)射波長(zhǎng)為660nm，在流式細(xì)胞儀中只有配有雙激光器的FL4才能檢測(cè)。
8). APC-Cy7是由APC 和Cy7組合而成的Tandem熒光素；其標(biāo)記的抗體適用于配備氦氖激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的多色流式細(xì)胞儀，APC-Cy7主要用于四色以上的流式細(xì)胞術(shù)。
2. 常見熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度比較
熒光的強(qiáng)度與染色指數(shù)(Stain Index)有關(guān)，染色指數(shù)的計(jì)算：Stain Index=D/W，染色指數(shù)越高，熒光強(qiáng)度越好；染色指數(shù)較低，染色強(qiáng)度相對(duì)較差：
通過染色指數(shù)可以看出各個(gè)熒光素的強(qiáng)度：PE>APC>FITC>PerCP
3. 多色流式細(xì)胞檢測(cè)中熒光素選擇的原則
a). 根據(jù)機(jī)器配置選擇熒光素 比如 BD calibour 流式儀，配置有兩色激光，能夠做 4 個(gè)通道的熒光素，需根據(jù)對(duì)應(yīng)的激光激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)通道選擇合適的熒光抗體
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多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個(gè)通道只能選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。FACSCalibur 常用的四色搭配：FITC, PE, PerCP, APC
b). 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱合理分配熒光素 明確檢測(cè)指標(biāo)的表達(dá)情況，可將其分為三個(gè)層次：
*層次抗原：這一類抗原通常表達(dá)穩(wěn)定且大多呈高表達(dá)狀態(tài)。如果該類抗原為高表達(dá)的話，可以將其與熒光強(qiáng)度較低的熒光素抗體相結(jié)合，如 Alexa Fluor 700，Brilliant Violet570TM，Brilliant Violet 785 TM 或 APC-Cy7。
第二層次抗原：這類抗原對(duì)于進(jìn)一步表型鑒定至關(guān)重要，但是在平行實(shí)驗(yàn)中表達(dá)量也會(huì)有所變化。該類抗原表達(dá)水平多變，通常適合與中度熒光強(qiáng)度的熒光素抗體結(jié)合，如 Brilliant Violet 510TM，Brilliant Violet 650TM，F(xiàn)ITC 或 PerCP-Cy5.5。
第三層次抗原：這類抗原有可能在不同樣本中表達(dá)差異很大甚至表達(dá)量未知。通常針對(duì)這類抗原市面上只有純化抗體，且其搭配的熒光素類型也較少。對(duì)于這類抗原的檢測(cè)要盡量選擇熒光素強(qiáng)度zui強(qiáng)的熒光素抗體，如 Brilliant Violet 421TM，PE，APC 或 PE-Cy7。
c). 選擇光譜重疊小的熒光素 由于熒光素的寬發(fā)射譜的特點(diǎn)，熒光通道間有光譜重疊現(xiàn)象，因此選擇試劑組合時(shí)要將光譜疊加可能性減到zui低。多色流式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候需要通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)消除光譜重疊的影響。比如 FITC和 PE，F(xiàn)ITC 的發(fā)射譜是 530/30，PE的發(fā)射譜是 585/42，部分發(fā)生重疊。如在進(jìn)行四色分析，經(jīng)常會(huì)將 PE-Cy5標(biāo)記的抗體與 APC 標(biāo)記的抗體搭配使用，此搭配需較大幅度地調(diào)節(jié)兩者的顏色補(bǔ)償?？蛇x用 PE-Cy5.5 來替代 PE-Cy5，顏色補(bǔ)償只需 1% 左右。因?yàn)?Cy5的激發(fā)波長(zhǎng)與 APC 的激發(fā)波長(zhǎng)相近，所以 PE-Cy5 熒光素中的 Cy5，也會(huì)被激發(fā) APC 的第二個(gè)激光器（氦氖激光器）所激發(fā)，導(dǎo)致 PE-Cy5 與 APC 的顏色補(bǔ)償很難調(diào)。相反，PE-Cy5.5 中的 Cy5.5 激發(fā)波長(zhǎng)為675nm，不能被激發(fā) APC 的第二個(gè)激光器所激發(fā)，也就不存在 Cy5.5 對(duì) APC的干擾，顏色補(bǔ)償也就很小。因此，可能需要犧牲個(gè)別的熒光的亮度來避免熒光滲漏以及敏感度喪失。 
要通過單標(biāo)對(duì)照進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)：
所以盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如 FITC/PE-Cy7;
選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如 FITC/APC, PE/APC。
d). 盡量避免偶聯(lián)染料使用帶來的假陽性 偶聯(lián)熒光染料是指兩種熒光素聯(lián)接在一起進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移。供方熒光素如 PE，APC 或 Brilliant Violet 421TM 被激光激發(fā)，然后通過共振將能量轉(zhuǎn)移給受體熒光素，如 PE-Cy7 中的 Cy7。若使用偶聯(lián)的熒光素，務(wù)必要在短時(shí)間內(nèi)盡快完成實(shí)驗(yàn)，曝光時(shí)間越長(zhǎng)，熒光素就越不穩(wěn)定。 