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實(shí)驗(yàn)室新手指南之質(zhì)粒的提取

閱讀:1918        發(fā)布時(shí)間:2017/12/22
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 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 操作步驟

1、挑取 LB 固體培養(yǎng)基上生長的單菌落,接種于 20ml LB(含

Amp100ug/ml)液體培養(yǎng)基中,37℃、250rmp 振蕩培養(yǎng)過夜(約

12-14hr)。

2、取 1.5ml 培養(yǎng)液倒入 1.5ml eppendorf 管中,12000rmp 離心1-2min。棄上清,將離心管倒置于衛(wèi)生紙上,使液體盡可能流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩,使菌體分散混勻。),室溫下放置 5-10 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,蓋緊管口,快速溫和顛倒 eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5 min,使細(xì)胞膜裂解(溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖?,故離心管中菌液逐漸變清)。

5、加入 150μl 預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口,將管溫和顛倒數(shù)次混勻,見白色絮狀沉淀,可在冰上放置 5min。 12000rmp 離心 10min。溶液Ⅲ為中和溶液,此時(shí)質(zhì)粒 DNA 復(fù)性,染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性,形成不可溶復(fù)合物,同時(shí) K+使 SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

6、上清液移入干凈 eppendorf 管中,加入等體積的酚/氯fang/異戊醇,振蕩混勻, 12000rmp 離心 10min。(450μl 的苯酚/氯fang/異戊醇)

7、小心移出上清于一新微量離心管中,加入 2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇,混勻,室溫放置 2-5min,離心 12000rmp×10min。

8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,12000rmp 離心 5 min。

9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,室溫干燥。

10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0,含20μg /ml RnaseA,約4μl) 中,37℃水浴 30min 以降解 RNA 分子,儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

實(shí)驗(yàn)試劑及配制

1、LB 液體培養(yǎng)基

稱取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaCl 10g,溶于 800ml 蒸餾水中,用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5,加水至總體積 1 升,高壓下蒸氣滅菌 15 分鐘。

2、氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 100mg/ml 水溶液, -20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

3、溶液Ⅰ50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0)。

配制方法:1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖 4.730g,加 ddH2O 至 500ml。在 121℃高壓滅菌 15min ,貯存于 4℃。

4、溶液Ⅱ0.2M NaOH,1% SDS

配制方法:2M NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加 ddH2O 至 10ml。使用前臨時(shí)配置。

5、溶液Ⅲ:醋酸鉀(KAc)緩沖液,pH 4.8

配制方法:5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加 ddH2O 至 500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

苯酚/氯fang/異戊醇(25:24:1)

氯fang可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開,異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。酚和氯fang均有很強(qiáng)的腐蝕性,操作時(shí)應(yīng)戴手套。

無水乙醇

70%乙醇

TE:

10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml , 0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml,加 ddH2O 100ml。121高壓濕熱滅菌 20min,4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1M Tris-HCl(Tris(三羥甲基)氨基甲烷)800ml H2O 中溶解 121g Tris 堿,用濃鹽酸調(diào) pH 值,混勻后加水到 1L。

0.5M EDTA(乙二胺四乙酸):700mlH2O 中溶解 186.1g Na2EDTA.2H2O,用 10M NaOH 調(diào) pH8.0(需約 50ml),補(bǔ) H2O 到 1L。

6、RNA 酶 A 母液:

將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisC· l(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加熱 15 分鐘,使混有的 DNA 酶失活。冷卻后用 1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于-20℃。

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