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上海乾思生物科技有限公司

基因甲基化檢測技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務

時間:2015-7-1閱讀:122

關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務
簡介:世界*品牌基因甲基化檢測技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務原裝,質(zhì)量保證,*。
基因甲基化檢測技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一,真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶,即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達,去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。
檢測程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物,如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進行PCR,在擴增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶,zui后對PCR產(chǎn)物進行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序,可以提高測序成功率,這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,HRM)
在非CpG島位置設(shè)計一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物,這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,用亞硫酸氫鹽處理后,未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的GC含量發(fā)生改變,從而導致熔解溫度的變化.
送樣要求
細胞(≥106 個)、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料,基因組DNA(體積≥20μl,濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點與程度的實驗方法有三類:
(1)(M SREs)利用對甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點,從而產(chǎn)生片段差異,電泳后,根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點與甲基化程度,
(2)另一類是利用將沒有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì),而甲基化的C不會發(fā)生相應變化來識別甲基化位點。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
(3)一種通過合成方法進行序列分析的方法,它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應,促使熒光素發(fā)光并進行檢測,Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù),這項技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因型和單倍型的檢測,以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術(shù)的一個主要特點是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來自于序列分析的原始數(shù)據(jù),通過峰值的高度可以的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率,這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織,并且具有較高的重復性和性。
 MSP 實驗流程:  
1.       基因組抽提;
2.       基因組DNA定量;
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(C轉(zhuǎn)化為U),本步實驗至關(guān)重要,轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果,所以,需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率;
4.       引物設(shè)計(每個基因設(shè)計兩對引物,分別為:甲基化引物M,非基因化引物U,對應擴增甲基化和非甲基化的目的片段),有時需設(shè)計巢式引物;
5.       PCR 擴增:對甲基化和非甲基化的目的片段分別擴增,此時盡可能使用梯度PCR儀,可以同時使用不同的退火溫度,以篩選合適的退火溫度;
6.       PCR 產(chǎn)物電泳;
7.       電泳結(jié)果分析(定性即有無甲基化,半定量即甲基化程度高低)。
BSP (亞硫酸鹽測序法)實驗流程:  
1.       基因組抽提;
2.       基因組DNA定量;
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(C轉(zhuǎn)化為U),本步實驗至關(guān)重要,轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實驗結(jié)果,所以,需要實驗者在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率;
4.       引物設(shè)計(每個基因設(shè)計一對引物,引物位置盡可能的避開DNA中的CG位點),有時需設(shè)計巢式引物;
5.       PCR 擴增:對實驗樣本進行PCR擴增,此時盡可能使用梯度PCR儀,可以同時使用不同的退火溫度,以篩選合適的退火溫度。
6.       PCR 產(chǎn)物電泳;
7.       對目的條帶進行切膠回收;
8.       回收后的PCR產(chǎn)物連接克隆載體(T載體);
9.       轉(zhuǎn)化E.coli H5α;
10.      挑選陽性克隆測序;
11.      測序結(jié)果分析:實驗專業(yè)甲基化分析軟件對測序序列進行甲基化分析,可以得到如下數(shù)據(jù):
     A. 測序序列與目的序列的相似度(%);
     B. C-T 轉(zhuǎn)化效率(%);
     C. 目的片段中每個CG的甲基化情況(點狀圖);
     D. 每個CG的甲基化率(%);

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