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上海拜力生物科技有限公司

基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

時間:2015-7-1閱讀:206

關(guān)鍵詞:基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介:世界*品牌基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,質(zhì)量保證,*。
基于慢病毒載體的miRNA載體構(gòu)建|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌:   http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程:
慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)??商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細(xì)胞的感染,目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,整合到基因組,從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。
miRNA是一種21-25nt長的單鏈小分子RNA, 是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成,miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性.而且這種特異性和時序性,決定了組織和細(xì)胞的功能特異性,表明miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用,因此miRNA的研究受到了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。 
本中心可以將客戶研究的miRNA構(gòu)建到慢病毒載體,生產(chǎn)的病毒顆粒可以直接用于感染細(xì)胞或者動物實(shí)驗(yàn)??梢赃x擇將Pri-miRNA或者PremiRNA構(gòu)建到載體,構(gòu)建中也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用不同的Flank.
特點(diǎn):
1.可以穩(wěn)定長期的表達(dá)miRNA,可以用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞模型用于長期的研究和觀察。 
2.感染效率高而且可以感染絕大部分細(xì)胞種類。 
3.可以直接用于動物實(shí)驗(yàn)或者感染細(xì)胞后回輸?shù)絼游矬w內(nèi)。
1.將actin基因,放入慢病毒融合表達(dá)載體,與熒光蛋白(GFP)融合表達(dá),注意避免移碼突變。
2.然后將重組質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可以用脂質(zhì)體法,慢病毒配套細(xì)胞一般為293。
3.收集慢病毒,濃縮。
4.用慢病毒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞。做好先做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
5.重組蛋白(例如,GFP-actin)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后,自然的混入細(xì)胞骨架中,將之標(biāo)記綠色熒光。
(一) 實(shí)驗(yàn)流程(1和2為并列步驟)
1.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物,同時引入酶切位點(diǎn),PCR(采用高保真KOD酶,3K內(nèi)突變率為0%)從模板中(CDNA質(zhì)粒或者文庫)調(diào)取目的基因CDS區(qū)(coding sequence)連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下,裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu),退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒,三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后6 h 更換為*培養(yǎng)基,培養(yǎng)24和48h后,分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實(shí)驗(yàn)材料
2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng),組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。

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