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蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)

閱讀:2644      發(fā)布時間:2020-1-2
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  蛋白質(zhì)印跡法是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。

  蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))即Western Blot,其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

  實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)

  1、樣品質(zhì)量。所抽取樣品的蛋白含量,蛋白變性是否充分等等,還有,蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外,蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對終結(jié)果的可靠性有影響。

  2、凝膠質(zhì)量。不連續(xù)SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高,分離膠的PH值應(yīng)在8.8左右,而濃縮膠的PH應(yīng)在6.8左右,不要差過0.5個PH單位,因?yàn)檫@個PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件,也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此,制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。

  3、點(diǎn)樣。樣品盡量不要與電泳液混合,這樣能提高濃縮的效果,因?yàn)殡娪疽篜H值為8.3,而樣品為7.5,混合后會影響到樣品的PH值,進(jìn)而影響濃縮效果。

  4、電泳緩沖液。盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定。

  5、電壓條件。我們經(jīng)常用的濃縮時80V,分離時100V比較好,條帶很平。

  6、轉(zhuǎn)膜。膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮。例如,要做分子量小于20kD的小蛋白,0.45μm的NC膜是不可取的,因?yàn)檫@樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定,從而影響到終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測序,則非PVDF膜不可,因?yàn)橹挥蠵VDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。

  7、抗體雜交與底物顯色。一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體,還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標(biāo)蛋白;二抗一般都是效價很高的,只要室溫下雜交1小時就可以了,適當(dāng)延長也是可以的。另外,要選擇靈敏度較高的化學(xué)反應(yīng)底物。如超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus,檢測級別可達(dá)pg級,發(fā)光時間長,穩(wěn)定。

 

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