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上海信帆生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第13年

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海藻糖含量試劑盒說明書

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海藻糖含量試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
海藻糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。由于海藻糖具有*的不同于其他碳
水化合物的生物學(xué)特性,能在干旱、高溫、脫水、冷凍、高滲透壓及毒性物質(zhì)等惡劣環(huán)境下
保護(hù)生物體細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、核酸等組分不受損害。
測(cè)定原理:
蒽酮比色法。具有靈敏度高﹑簡(jiǎn)便快捷﹑適用于微量樣品的測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研缽、濃硫酸(不允許快遞)
和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體 50ml×1 瓶,4℃保存;
試劑一:粉劑×1 瓶,4℃保存;
海藻糖提取:
1、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104
個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),
超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復(fù) 30 次),室
溫靜置 45min,振蕩 3~5 次,冷卻后,8000g25℃離心 10min,取上清。
2、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例(建議稱取約 0.1g
組織,加入 1mL 提取液),冰浴勻漿,室溫靜置 45min,振蕩 3~5 次,冷卻后,8000g,25
離心 10min,取上清。
3、血清(漿)的處理:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)15~10 的比例(建
議取 0.1mL 血清(漿)加入 1mL 提取液),冰浴勻漿,室溫靜置 45min,振蕩 3~5 次,冷卻
后,8000g,25℃離心 10min,取上清。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。
3、工作液的配制:臨用前在試劑一中加入 7.5mL 蒸餾水后,緩慢加入 42.5mL 濃硫酸,不
斷攪拌,充分溶解,待用;用不完的試劑 4℃保存一周;
4、樣本測(cè)定:取 0.25mL 樣本和 1mL 工作液至 EP 管中,95 度水浴 10 min(蓋緊,防止水
分散失),自然冷卻至室溫,在 620 nm 波長(zhǎng)下記錄測(cè)定吸光度值 A
注意:由于工作液具有強(qiáng)腐蝕性,請(qǐng)謹(jǐn)慎操作。
若吸光值大于1,請(qǐng)將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。海藻糖含量計(jì)算:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 8.8976x+0.0729;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y 為吸光值。
2、按樣本鮮重計(jì)算:
海藻糖含量(mg/g 鮮重)= [V1×(A -0.0729)÷8.8976]÷(W×V1÷V2)=0.112×(A -0.0729) ÷W。
3、按樣本蛋白濃度計(jì)算:
海藻糖含量(mg/mg prot)=[ V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(V1×Cpr)=0.112×(A -0.0729) ÷Cpr
4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
海藻糖含量(μg/104 cell)=[1000×V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(500×V1÷V2)=0.224×(A
-0.0729)
5、血清(漿)海藻糖含量計(jì)算
海藻糖含量(mg/mL)=[V1×(A -0.0729÷8.8976 )]÷(V3×V1÷V2)=1.12×(A -0.0729)
10001mg/mL=1000µg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.25 mL;V2:加入提取液總
體積 1mL;V3:加入血清(漿體積),0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)
量,g500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
注意:zui低檢測(cè)限為 10μg/g 鮮重或 0.1μg/ mg prot

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