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PCR擴增反應(yīng)三部曲以及DNA(靶序列)的制備的步驟

時間:2015/8/18閱讀:3051
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聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體外擴增特異性DNA片段的技術(shù)。它可以在體外特異地對目的基因進行大量擴增,其巧妙之處在預(yù)先設(shè)計合成二段分別與待測目的基因二端互補的引物,以起到指向定點的作用;再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴增反應(yīng)后,即可使特定的基因片段成百萬倍的擴增。擴增反應(yīng)分三步:
①變性:當通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離形成單鏈DNA。
②褪火:當溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多,而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈,而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少。
③延伸:在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物,以及Mg2+存在的條件下,
以引物為起始點,從5′→3′催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。
以上3步為一個循環(huán),每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一循環(huán)的模板,若干次循環(huán)之后,介于兩個引物之間的特異性DNA片段就得到了大量的復(fù)制,數(shù)量可達2×107~8拷貝,PCR的實驗操作包括模板DNA(或RNA)的制備、引物的設(shè)計合成、酶促聚合反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物的檢測等。
操作步驟
模板DNA(靶序列)的制備
進行PCR擴增反應(yīng)的模板可以是人體組織細胞的染色體DNA,微生物的DNA,或是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA等。本實驗用小鼠肝臟制備染色體DNA作為PCR擴增的模板。
1. 取肝組織0.5g加入2ml裂解液。
2. 冰浴勻漿。
3. 取勻漿液200μl加入裂解液200μl。
4. 加入蛋白酶k至終末濃度為100μg/ml。
5. 以上溶液在65℃保溫數(shù)小時或過一夜,不時震搖。
6. 加入75μl 8M KAC,混勻。
7. 在4℃放置15分鐘。
8. 加入750μl氯仿。
9. 經(jīng)充分震搖后5 000rpm、離心5分鐘,將上清液轉(zhuǎn)入一新的Eppenderf管,沉淀棄去。
10. 加入750μl無水乙醇,充分混勻,-20℃靜置30分鐘。
11. 12 000rpm、離心10分鐘,棄去上清,沉淀用500μl 70%乙醇洗一次,10 000rpm、再離心5分鐘,棄去上清,于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15~30分鐘,使痕量乙醇揮發(fā)。
12. 將DNA沉淀團塊溶于100μl TE緩沖液,加RNA酶1μl,在37℃水浴放置30分鐘。
13. 用等體積的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清,加入1/10體積的NaAc(pH4.8)和2倍體積的無水乙醇,混勻。
15. 12 000rpm、離心10分鐘,棄去上清,沉淀用500μl 70%乙醇洗一次,10 000rpm,再離心5分鐘,棄去上清,于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15~30分鐘,使痕量乙醇揮發(fā)。溶于50μl TE。
16. 取1μl樣品用500μl雙蒸水稀釋,在260nm和280nm處測定吸光度。鑒定樣品純度并計算其含量。
17. 將DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/P>

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