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超純水的內(nèi)毒素定量測定

     革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌（E. coli）和假單胞菌(Pseudomonads)等的細(xì)胞壁成分被認(rèn)為是內(nèi)毒素。它們具有一個親水性多糖和親脂性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，有別于它們所源自的細(xì)菌,具有高度的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。內(nèi)毒素屬于致熱源，如果它們與粘膜發(fā)生接觸或者一旦它們進(jìn)入血液循環(huán)，便會導(dǎo)致發(fā)熱（參考文獻(xiàn)詳見Steck, 20061）。
     根據(jù)通用的藥典，在藥物的生產(chǎn)工藝中內(nèi)毒素含量不可超出所規(guī)定的限值。 
    在生物制藥（如：免疫球蛋白）生產(chǎn)所需的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中，內(nèi)毒素的出現(xiàn)可能會導(dǎo)致死亡。因此，在生物制藥生產(chǎn)、細(xì)胞系傳代，或者細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要使用超純培養(yǎng)基，當(dāng)然也相應(yīng)的需要超純水，它們所含有的內(nèi)毒素含量水平已獲證明低于所規(guī)定的限值。 
    本研究的目的在于展示Arium pro VF系統(tǒng)產(chǎn)生的超純水所具有的內(nèi)毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)定的限值，因而可用于上述各種應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)方法

    為了對Arium pro VF系統(tǒng)所生產(chǎn)的超純水中的內(nèi)毒素含量進(jìn)行檢測，我們分別采用了凝膠法和顯色法來測試。

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的濃度范圍內(nèi)，凝膠法顯示的是陰性結(jié)果，意即無凝膠形成（無內(nèi)毒素檢測到；見表1）；當(dāng)濃度≥0.1 EU/ml時發(fā)生了凝集反應(yīng)。該結(jié)果顯示了在凝膠法的檢測敏感限值內(nèi)，在Arium pro VF系統(tǒng)所生產(chǎn)的超純水中未出現(xiàn)內(nèi)毒素。

     顯色法中，在405nm波長處的60吸附讀數(shù)（見下圖）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)毒素含量的不同生成了不同斜率的曲線。達(dá)到吸收率所需要的時間通過特殊的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行計(jì)算，并將之用為推斷具有未知內(nèi)毒素含量的樣品的依據(jù)（具體的值詳見表1-顯色測試）。由于具有zui低濃度（0.005-0.001 EU/ml）的標(biāo)準(zhǔn)樣品和Arium水未達(dá)到所需的計(jì)算內(nèi)毒素含量的消光值，因此它們被認(rèn)定為低于檢測限值。

     Arium pro VF超純水所獲得的值明顯比0.001 EU/ml曲線的繪制點(diǎn)更加低。下圖顯示了與兩個選定的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（0.05 EU/ml and 0.005 EU/ml）相比，在自來水、去離子水（DI水）和Arium水中所測得的內(nèi)毒素濃度的數(shù)據(jù)集合。在水樣品中的內(nèi)毒素含量通過使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)所測得的值來計(jì)算，詳見表2.。

     在DI水樣品中，檢測到內(nèi)毒素為0.02 EU/ml，這個值低于WFI（注射用水）現(xiàn)行的有效值。在自來水中，出乎意料地檢測到高達(dá)25 EU/ml的內(nèi)毒素載量。該結(jié)果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統(tǒng)所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常見的限值。 
     在DI水樣品中，檢測到內(nèi)毒素為0.02 EU/ml，這個值低于WFI（注射用水）現(xiàn)行的有效值。在自來水中，出乎意料地檢測到高達(dá)25 EU/ml的內(nèi)毒素載量。該結(jié)果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統(tǒng)所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常見的限值。

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 結(jié)論

     測試結(jié)果顯示了Arium pro VF系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水可作為一種方便、實(shí)惠的選擇，用于內(nèi)毒素測試的樣品制備，因?yàn)樵谄渌a(chǎn)的超純水中檢測到的內(nèi)毒素濃度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的結(jié)果也證實(shí)了早期關(guān)于在Arium超純水中發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素載量<0.001 EU/ml的試驗(yàn)。
     在此超純水中的內(nèi)毒素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國藥典所規(guī)定的限值，這也使得該超純水理論上適用于制藥產(chǎn)品的生產(chǎn)/內(nèi)毒素監(jiān)測方面。相關(guān)的例子包括產(chǎn)品制劑，透析過濾解決方案，層析緩沖液以及用于萃取、清洗、無菌步驟和細(xì)胞培養(yǎng)方案的水等。 
     在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用范圍內(nèi)，我們需要在工藝的各個步驟都對污染物保持高度警惕。為了對內(nèi)毒素對細(xì)胞培養(yǎng)物及細(xì)胞敏感度的影響保持可控，尤其是與此類內(nèi)毒素相關(guān)時，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基都必須要明確不含可檢測到的內(nèi)毒素含量（見參考文獻(xiàn)5）。

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參考文獻(xiàn)/更多信息

1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006. 
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009. 
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany. 
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007. 
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012

致謝

我們要特別鳴謝德國Laupheim的Stephanie Steck of Rentschler Biotech¬nologie的Stephanie Steck博士，感謝他百忙之中抽空審查此篇文章并就相關(guān)主題開展了建設(shè)性的討論。