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?抗體發(fā)現(xiàn)是開(kāi)發(fā)單克隆抗體藥物、雙特異抗體藥物、ADC 藥物和Car-T細(xì)胞治療藥物的必經(jīng)之路。目前，單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的技術(shù)主要有雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和單B細(xì)胞篩選技術(shù)。其中單B細(xì)胞篩選技術(shù)由于其研發(fā)周期短而備受矚目。

該技術(shù)將單細(xì)胞分離鑒定與分子生物學(xué)結(jié)合，獲得單個(gè)B細(xì)胞抗體基因并進(jìn)行體外克隆和表達(dá)，獲得的抗體保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)；相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)，具有效率高、全人源、基因多樣性豐富、細(xì)胞數(shù)量少、周期短、適用于任意動(dòng)物抗體篩選等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于抗原特異性細(xì)胞的比例較低，需要借助高通量及高靈敏的分選系統(tǒng)對(duì)少量的特異性 B 細(xì)胞進(jìn)行富集。

近期，Amgen提出了一種使用CellCellector 全自動(dòng)無(wú)損細(xì)胞分離系統(tǒng)從用重組治療蛋白EGFR 免疫的Xeno Mouse R（XM）中分離單個(gè)抗原特異性原代B細(xì)胞的方法。這種方法為抗原特異性抗體的分離和驗(yàn)證提供了一個(gè)快速、高效和經(jīng)濟(jì)的平臺(tái)。

整篇研究，思路清晰，流程簡(jiǎn)單，解析如下：

1 使用CellCelector Flex全自動(dòng)無(wú)損細(xì)胞分離系統(tǒng)分離EGFR特異性B細(xì)胞

從三只接種EGFR-ECD（EGFR的ECD結(jié)構(gòu)域）的小鼠身上獲得了200 萬(wàn)個(gè)CD138 陽(yáng)性的抗體分泌細(xì)胞（antibody-secreting cells，ASCs），這些小鼠顯示出EGFR滴度。CD138（Syndecan-1）的表達(dá)已被用于廣義地定義ASC 群體。

1、我們將60,000個(gè)細(xì)胞加載到包含約60,000個(gè)納米孔/孔的六孔板（CellCelector特色耗材）中，以實(shí)現(xiàn)平均每個(gè)納米孔一個(gè)細(xì)胞。

2、將抗人IgG Fc 特異性beads、抗人IgG連接的Alexa Fluor647（AF647）、生物素化的EGFR和AlexaFluor488（AF488）連接的鏈霉親和素的混合物與細(xì)胞進(jìn)行孵育。

3、通過(guò)CellCelector的明場(chǎng)和熒光通道成像功能掃描了52,000個(gè)納米孔，以確定含有分泌抗體（AF647+）和與EGFR結(jié)合陽(yáng)性（AF488+）的B細(xì)胞。

4、最終確定了1,189個(gè)含有ASCs（IgG-AF647陽(yáng)性）的納米孔和238個(gè)含有EGFR特異性ASCs（AF488和AF647雙陽(yáng)性）的納米孔，利用CellCelector導(dǎo)出94個(gè)EGFR陽(yáng)性的ASCs用于IgG重鏈和輕鏈的分子回收（圖1）。

圖1. 雙陽(yáng)性細(xì)胞的代表性熒光和明場(chǎng)圖像。

A) 647nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光特異性圖像（紅色）；觀察到兩個(gè)鄰孔含有ASCs；(B) 488nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光特異性圖像（綠色），觀察到相鄰的一個(gè)孔含有EGFR特異性的ASC；(C)647和488nm通道的圖像疊加；(D)用于挑選EGFR+ASC的明場(chǎng)圖像；(E)從納米孔中挑取EGFR+ASC之前的明場(chǎng)圖像和(F) 從納米孔中挑取EGFR+ASC之后的明場(chǎng)圖像。

CellCelector 的優(yōu)勢(shì)在于：

1、用于自動(dòng)調(diào)整毛細(xì)管高度的SurePick™ 技術(shù)，在挑選過(guò)程中對(duì)毛細(xì)管高度進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，允許從高度不平或半固體表面進(jìn)行高效的全自動(dòng)挑選

2、用于高通量篩選的Nanowell 納米孔板技術(shù)，每個(gè)納米板含有十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)個(gè)納米孔，實(shí)現(xiàn)更高通量的細(xì)胞分選

3、支持全板掃描，每次挑取僅需20-30s，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間短，自動(dòng)化程度高

4、全流程存檔記錄及質(zhì)量控制，完全自動(dòng)化的質(zhì)量控制過(guò)程，包括揀選前后的圖像、揀選/失敗報(bào)告和數(shù)據(jù)/圖像輸出

5、適用于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞或半固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞；單細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)，球體或菌落；原代細(xì)胞或細(xì)胞系；活細(xì)胞或固定細(xì)胞

6、一機(jī)全能，集分選、成像和挑取為一體

2 通過(guò)iQue® 高通量流式細(xì)胞儀在細(xì)胞水平檢測(cè)抗體結(jié)合能力

通過(guò)RT-PCR進(jìn)行IgG重鏈和輕鏈擴(kuò)增并進(jìn)行了測(cè)序，成功克隆、表達(dá)和純化了20個(gè)獨(dú)特的抗體序列。這20個(gè)序列被克隆到人IgG1同型的表達(dá)載體中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，5天后收獲含有抗體的培養(yǎng)基上清，使用Octet® 對(duì)上清液進(jìn)行定量分析，確定其濃度在22至398mg/L之間。使用iQue3® 高通量流式細(xì)胞儀測(cè)定20種表達(dá)抗體與CHO細(xì)胞上瞬時(shí)表達(dá)的EGFR的特異性結(jié)合（圖2A）

圖2. 20個(gè)表達(dá)的克隆的表征。

(A)通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定抗體與表達(dá)EGFR的CHO細(xì)胞的結(jié)合；(B)用BLI測(cè)定抗體對(duì)可溶性EGFR的親和力；(C)三個(gè)有代表性的親和力檢測(cè)結(jié)果圖顯示了與可溶性EGFR的高親和力（<1nM）、中等親和力（1-10nM）和無(wú)結(jié)合。

iQue® 高通量流式的優(yōu)勢(shì)在于：

1、氣泡分隔的連續(xù)采樣技術(shù)，使流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)入高通量篩選(HTS)領(lǐng)域

2、最小樣本體積達(dá)到10uL，支持384、1536孔板采樣，96孔板只需5min

3、ForeCyt軟件、比起傳統(tǒng)流式更簡(jiǎn)單的使用及維護(hù)，硬件配套軟件，是高通量流式篩選必備儀器

3 Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)從分子水平檢測(cè)抗體結(jié)合能力

通過(guò)Octet® 測(cè)定抗體對(duì)可溶性EGFR的親和力。AHC傳感器固化抗體，然后與EGFR結(jié)合解離，EGFR的濃度范圍為1.56nM至100nM。結(jié)果分為3類：高親和力（<1nM）、中等親和力（1–10nM），與可溶性EGFR無(wú)結(jié)合（圖2B和C）。流式結(jié)果和Octet®檢測(cè)結(jié)果一致。因此，能夠確認(rèn)來(lái)自原代B細(xì)胞的分離序列與天然EGFR細(xì)胞和可溶性EGFR蛋白有明顯結(jié)合。

Octet®非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于：

1、非標(biāo)記Direct binding是趨勢(shì)，結(jié)果更準(zhǔn)確

2、快速測(cè)定親和力，更加定量化地表征分子互作

3、無(wú)洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）

4、寫入了美國(guó)藥典，文章多，認(rèn)可度廣

5、萬(wàn)金油技術(shù)，可以用于檢測(cè)DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子；如這篇文章檢測(cè)的就是病毒顆粒樣品

6、操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低

7、高通量，本文使用RH96，可以同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品

總結(jié)

本研究通過(guò)CellCelector平臺(tái)快速高效的篩選和分離ASCs，獲得陽(yáng)性B細(xì)胞序列后，結(jié)合iQue® 高通量流式細(xì)胞平臺(tái)以及Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)，3-4周內(nèi)成功獲得抗原特異性抗體，為大家解析了如何利用賽多利斯新三劍客快速高效的進(jìn)行高單B細(xì)胞篩選的典型流程，為新型抗體藥物的發(fā)展指引了新的方向。