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NAD/NADH檢測試劑盒|NAD/NADH Assay Kit

產(chǎn)品描述

煙|酰|胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）是細(xì)胞中常見的重要輔因子，通過電子交換參與各種代謝反應(yīng)。NADH（還原性輔酶I）是NAD的還原態(tài)。在氧化還原反應(yīng)中，NADH作為氫和電子的供體，NAD作為氫和電子的受體，參與多種生理過程。NAD/NADH比率可以反應(yīng)細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)。

NAD/NADH檢測試劑盒|NAD/NADH Assay Kit試劑盒適用于測定NAD和NADH，背景低，靈敏度高。NADH可以將探針還原為高熒光產(chǎn)物，其信號可以通過熒光酶標(biāo)儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測定(OD =576 nm)中定量。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。避光保存于-20℃，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前請先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。

4 請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。

5 本產(chǎn)品僅用于科研用途。

實(shí)驗(yàn)過程

1 試劑準(zhǔn)備

① NADH標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADH Standard（C組分）中制備1 mM NADH標(biāo)準(zhǔn)品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復(fù)凍融。

② NADH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(0-10 μM)：將970 μL PBS (pH 7.4)加入到30 μL NADH標(biāo)準(zhǔn)母液(1 mM)中制備30 μM NADH標(biāo)準(zhǔn)液，然后取200 μL的30 μM NADH標(biāo)準(zhǔn)液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(10 μM, 3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.0411 μM)。

【注】：稀釋后的NADH標(biāo)準(zhǔn)液不穩(wěn)定，應(yīng)該配置后4 h內(nèi)使用。

③ NAD/NADH反應(yīng)液：向每瓶NAD/NADH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADH Sensor Buffer（B組分），混勻。

【注】：相當(dāng)于96孔板的125次測試的檢測用量。NAD/NADH反應(yīng)液不穩(wěn)定，注意避光并盡快使用，未用完的分裝-20°C保存。

④ NAD/NADH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復(fù)至室溫。

2 樣本制備

2.1 細(xì)胞樣本：收集0.5-1×107個細(xì)胞，預(yù)冷PBS潤洗后，加入100 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測。

2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預(yù)冷PBS潤洗后，加入400 μL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.3 細(xì)菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細(xì)菌，每107個細(xì)菌加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NAD/NADH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測。

【注】：建議使用新鮮樣本，如果無法及時進(jìn)行檢測，樣本建議存于-80 °C，檢測時冰上解凍，但是檢測的熒光值可能會降低。不要使用RIPA裂解液，因?yàn)镽IPA裂解液會干擾檢測。如果樣本中NADH含量高，注意稀釋樣本。

3 檢測過程

3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADH標(biāo)準(zhǔn)液、待測樣本或空白對照(PBS)。

Table 1. Layout of NADH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

NS= NADH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated with NAD/NADH Control Solution , TS (NADH) = test sample treated with NADH Extraction Solution, then neutralized by NAD Extraction, TS (NAD) = test sample treated with NAD Extraction Solution, then neutralized by NADH Extraction Solution

3.2 對于NADH的提取TS (NADH)：向待測樣本中加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E）中和。

3.3 對于NAD的提取TS (NAD)：向待測樣本中加入25 μL NAD Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADH Extraction Solution（組分D）中和。

3.4 對于總NAD和NADH檢測TS (Total)：向待測樣本中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F）。

3.5 對于NADH標(biāo)準(zhǔn)液NS1-7：向NADH標(biāo)準(zhǔn)液中加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，

再加入25 μL NAD/NADH Control Solution（組分F）。

Table 2 Reagent composition for each well

3.6 每孔中加入75 μL NAD/NADH反應(yīng)液（測試總體積150 μL），混勻后，室溫避光孵育15 min-2 h。

3.7 熒光酶標(biāo)儀下測量熒光讀值(Ex/Em=540/590 nm)；也可以使用白色透明96孔板，使用酶標(biāo)儀在OD=576±5nm的波長下讀數(shù)，但靈敏度低于熒光檢測。

【注】：高濃度的NADH（終濃度>300 μM）會導(dǎo)致熒光讀值下降，因?yàn)镹ADH sensor被過度氧化，生成非熒光產(chǎn)物。

數(shù)據(jù)分析

1 從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值，以獲得基線校正值，熒光背景會隨時間而增加，因此標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣本的熒光讀值計(jì)算前需減去空白孔的熒光強(qiáng)度值。然后，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。

圖1 NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線

加入75 μL NAD/NADH反應(yīng)液后室溫避光孵育30 min后，熒光酶標(biāo)儀下測量熒光讀值。

2 樣本中NAD含量計(jì)算公式：NAD concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的測試樣本中NAD的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數(shù)。

3 樣本中總NAD和NADH含量計(jì)算公式：Total concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的測試樣本中總的NAD和NADH的含量(μM)，V代表測試樣本體積(μL)，D代表測試樣本稀釋倍數(shù)。

4 在健康的哺乳動物細(xì)胞中，NAD比NADH多，因此我們建議使用總NAD和NADH含量減去NAD來計(jì)算NADH的量。

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