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產品簡介
產品介紹
Lymphocyte Separation Medium 1.084
淋巴細胞分離液 1.084
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） |
Lymphocyte separation medium1.084 淋巴細胞分離液1.084 | 40504ES60 | 100ml | 4-30 °C | 499.00 |
產品描述
淋巴細胞分離液（Lymphocyte Separation Medium 1.084，簡稱LSM-1.084）是一種無菌的即用型分離液，基于Böyum的Ficoll-甲泛影鈉溶液做過一些改良，使得操作簡單快速且分離效率更高。本品是無菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸鈉混合溶液，密度為1.084 g/ml，內毒素含量很低（＜0.12 EU/ml），是在嚴格控制的環(huán)境下加工生產的，生產條件符合ISO13485:2003標準和GMP認證。相對于密度為1.077 g/ml的人淋巴細胞分離液，本品適用于分離更高密度的人單個核細胞，包括外周血，臍帶血以及骨髓瘤來源的組織樣本。還適用于分離大小鼠血細胞，正因為嚙齒動物的淋巴細胞密度稍高于人淋巴細胞。
工作原理
去纖維蛋白或抗凝人血以1：1的比例用無菌生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋，小心的添加在分離液上層（不要混雜在一起），之后離心30-40min。離心過程中，差速遷移使其zui終形成幾個不同的細胞分層：
① 聚集在管底的顆粒主要是Ficoll 聚集的紅細胞以及沉淀物；
② 緊挨著上面一層的顆粒主要是粒細胞，其處于LSM-1.084溶液的滲透壓臨界，具有足夠高的密度遷移穿過LSM-1.084溶液層。
③ 單個核細胞分布在血漿和LSM-1.084分離液的中間層，還包括一些沉降系數低（密度低）的顆粒，如血小板。
淋巴細胞，單核細胞和血小板不具有足夠高的密度穿透LSM-1.084分離液層，因此這些細胞在血漿和LSM-1.084分離液層聚集形成一個中間分層。吸取中間層，用平衡鹽溶液短暫洗滌，以除去血小板，細胞分離介質和血漿，就可以單個核細胞。通常情況下，分離所得的細胞中95±5%為單個核細胞，細胞存活率＞90%，回收率為60±20%。
運輸與保存方法
室溫運輸。
4-30 °C密閉避光環(huán)境下可穩(wěn)定保存3年。開瓶后需4-8 °C保存。
影響單個核細胞分離效果的因素
- 血液樣品保存時間
血液盡可能新鮮且無血塊。血液放置過久可能會降低細胞存活率、回收率，甚至有可能引入粒細胞和/或紅細胞污染。
- 血液體積
血液量和管徑決定樣本在管子中的高度，以及后續(xù)的離心時間。提高離心管內的血液高度會引入紅細胞污染的可能。但是分離效率不會明顯受管徑的影響。因此，對于體積大的血樣，建議可在保持離心時間不變的情況下選擇更大直徑的離心管。
- 紅細胞去除效率
單個核細胞分離的產量和純度與紅細胞是否去除干凈有關。
若全血中紅細胞發(fā)生凝集會導致一些單個核細胞也被聚集在內，從而在離心后被沉降在紅細胞層內?？赏ㄟ^稀釋全血的方法來避免此現(xiàn)象。溫度大小會影響紅細胞的凝集，18℃條件能提供*的分離效果。若溫度升高（如37℃）會提高紅細胞凝集的可能，降低分離效果。低溫（4℃）環(huán)境紅細胞聚集可能降低，需要增加離心時間。提高離心時間到5-10min能減低紅細胞污染。
- 血小板污染
對于血小板要求較為嚴格的分離實驗，使用4-20%的蔗糖梯度層加在LSM-1.084溶液層上方，再次離心以去除所有的血小板。離心后，血小板分布在蔗糖溶液上方，單個核細胞穿過蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方。
操作方法
- 材料準備
- 樣本體積（4ml總體積）：取2ml的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2ml）的無菌鹽溶液以1：1比例混合。注：大體積的血樣可以得到相同的分離效率，只需要選用更大直徑的離心管，以維持血樣的高度（約3cm）和LSM-1.084溶液的高度（約2.4cm）。
- LSM-1.084分離液，使用前需放到室溫環(huán)境下溫度平衡10-30min；
- 平衡鹽溶液：用做稀釋和清洗液，建議直接購買商業(yè)化的鹽溶液。也可以使用其他溶液，如不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽溶液（如DPBS溶液），Hank’s，或者細胞培養(yǎng)液（如RPMI 1640）。
- 分離單個核細胞
- 取2ml的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2ml）的無菌鹽溶液以1：1比例混合，于10-15ml離心管中顛倒混勻，或用槍上下輕輕吹打數次以至混勻。
注：肝素、EDTA、檸檬酸鈉、ACD、CPD抗凝皆可。去纖維蛋白血不需要抗凝劑。
- 使用前輕輕顛倒瓶子使LSM-1.084充分混合，用注射器或槍頭無菌條件轉移3 ml LSM到10-15 ml離心管中。
- 小心將稀釋血液加入3 ml LSM-1.084（室溫即可）的上層，使得在血液和LSM間形成一個明顯的分層。不要將稀釋血液混入LSM-1.084中，如圖1；
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圖1 加樣后分層示意圖
4）室溫下400×g離心30-40min，離心可以沉淀紅細胞和多形核白細胞，同時可以在LSM-1.084上形成一層單核-淋巴細胞分層，如圖2所示（從上到下，依次分為血漿層-單個核細胞層-LSM-1.084層-粒細胞-紅細胞）；
5）用無菌槍頭吸掉單個核細胞層（含淋巴細胞和單核細胞）上方2-3mm的血小板/血漿，小心操作勿吸入單個核細胞層內破壞其平衡（如圖2）。
注：也可以不用先吸走血漿層，直接用槍吸取單個核細胞層。另外，上層血漿不含細胞，也可以留作他用。
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圖 2 吸除上層血漿和血小板前后分層示意圖
6）用無菌槍頭將單核細胞層轉移入一個新的無菌離心管。
注：一定要吸取所有的單個核細胞中間層，以及少量上方的血漿液和下方的LSM-1.084分離液。
7）預估轉移后的單個核細胞量，加入至少3倍體積（約6ml）的平衡鹽溶液于上述離心管中。
8）使用槍頭上下輕輕吹打將單層細胞溶液充分懸浮。
9）室溫400-500×g離心10-15min。
注：高速離心有助于提高單個核細胞的回收率，但如果需要*去除血小板，則推薦低速離心（60-100×g）。
10）去除上清，加入6-8ml平衡鹽溶液重懸單核細胞。
11）室溫400-500×g（或者60-100×g去除血小板）離心10min。
12）去除上清，用適當培養(yǎng)基重懸單個核細胞備用。
3. 分離粒細胞
1）-6）同上方單個核細胞的分離步驟。
7）小心吸除LSM-1.084層，注意切勿吸入粒細胞層。
8）轉移暴露在表面的白色粒細胞層（位于紅細胞層上方）于一個無菌的50ml離心管。
9）加入至少5倍體積的平衡鹽溶液重懸粒細胞，于400×g離心15min。
10）吸除上清，加入6-8ml平衡鹽緩溶液重懸粒細胞，于室溫400-500×g離心10min。
11）吸除上清，用適當培養(yǎng)液重懸粒細胞備用。
注意事項
- 稀釋去纖維蛋白血液或肝素化血液用的鹽溶液為無菌液體；
- 為保持淋巴細胞的活性，應該采血后盡快進行分離。分離細胞層實際上是單個核細胞層，包括淋巴細胞和單核細胞。
- 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；
