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支原體概念和污染的影響
支原體（Mycoplasma）又稱霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、簡單的無細胞壁的原核生物，直徑大小0.1~0.3μm，能通過濾膜且呈高度多形性，是哺乳動物細胞培養(yǎng)中相對常見且難以檢測的污染物。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。
支原體（mycoplasma）是細菌中最小的一種微生物，在生物學(xué)分類中屬于柔膜菌門、柔膜菌綱，又分屬于不同目科屬。其中研究較多的支原體目、支原體科，主要包含支原體屬、脲原體屬兩個種屬。
支原體污染對細胞培養(yǎng)造成多方面的不良影響，已經(jīng)成為在細胞培養(yǎng)時的一個嚴重問題，保守估計常規(guī)細胞培養(yǎng)中支原體污染率為15~35%，嚴重干擾實驗結(jié)果的可信度。
細胞培養(yǎng)中95%的支原體污染主要是由萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體、口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、豬鼻支原體引起的。支原體在培養(yǎng)基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀。細胞培養(yǎng)上清和細胞膜適宜支原體生長，寄生在細胞表面的支原體可以穿透宿主細胞膜。
支原體污染來源主要有：細胞培養(yǎng)液或其成分（如培養(yǎng)基原料、血清和其他試劑）、實驗室操作人員、細胞培養(yǎng)箱、液氮培養(yǎng)箱、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過度使用、密封不當?shù)募毎囵B(yǎng)物和污染了支原體的細胞等。
與此同時，這些污染對應(yīng)的危害為：導(dǎo)致細胞制品或以細胞為介質(zhì)進行生產(chǎn)的產(chǎn)品在下游純化過程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報廢、污染其接觸的所有相關(guān)設(shè)備設(shè)施甚至中間或終產(chǎn)品、導(dǎo)致其他正常細胞受到支原體污染、導(dǎo)致重要細胞或病毒種子庫受到支原體污染而報廢、導(dǎo)致實驗室整體環(huán)境受到污染而被迫停止生產(chǎn)或?qū)嶒灢僮鬟M行支原體去除、導(dǎo)致支原體產(chǎn)生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴大、對實驗室中的其他細胞培養(yǎng)物造成威脅。
圖3. 支原體污染的危害
因此，定期進行支原體檢測和去除，確保無支原體存在細胞培養(yǎng)體系內(nèi)才能保障科學(xué)研究工作的正常進行。
支原體檢測方法介紹
在生物制藥和細胞研究中，支原體污染是一個嚴重的問題，因為它可能影響實驗結(jié)果和產(chǎn)品質(zhì)量。因此，支原體檢測對于確保細胞培養(yǎng)物和生物制品的安全性和可靠性至關(guān)重要。
目前常用的支原體檢測方法包括培養(yǎng)法、PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）法、熒光染色法、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）法、qPCR（實時定量PCR）、代謝活性測定（eg. ATP酶法）等。各種支原體檢測方法優(yōu)缺點如下：
序號 | 方法類型 | 靈敏度 | 專屬性 | 優(yōu)點 | 缺點 |
1 | 培養(yǎng)法 | 高 | 高 | 1.靈敏度高 | 1.需要建立P2實驗室； |
2 | 指示細胞法 | 高 | 低 | 1.藥典(ChP, EP, USP, JP)推薦方法； | 1.需要建立P2實驗室； |
3 | NAT法 （基于核酸擴增技術(shù)） | 高 | 取決于引物/探針序列 | 1.藥典推薦的傳統(tǒng)替代方法； | 1.檢測結(jié)果可靠性高度依賴于所制備樣本的質(zhì)量； |
4 | ELISA法 | 中 | 中 | 1.實驗簡單、快速，~5h; | 1.依賴于抗體，存在局限性； |
5 | ATP酶法 | 中 | 高 | 1.實驗簡單、快速； | 1.需要搭配熒光檢測儀器； |
6 | 等溫擴增法 | 高 | 中 | 1.實驗簡單、快速 | 1.肉眼觀察結(jié)果； |
表1.不同支原體檢測方法對比
合適支原體檢測方法的建立，需要考慮檢測結(jié)果僅用于參考還是用于產(chǎn)品相關(guān)樣本等的放行，是否符合法規(guī)藥典要求、是否做了方法驗證確認了方法的靈敏度、專屬性和耐用性，是否與藥典方法可比等。
若涉及產(chǎn)品放行的支原體檢測，需使用藥典規(guī)定方法，即培養(yǎng)法或指示細胞法，或者經(jīng)驗證與藥典規(guī)定可比的NAT法（如qPCR法，一般驗證越早開展越好）。
若不涉及產(chǎn)品放行的支原體檢測，即對于日常檢測用細胞或者研發(fā)早期的細胞等，快速檢測支原體的方法作為，其中包括巢式PCR法、LAMP等溫擴增法、qPCR法、ATP酶法和ELISA法。
支原體巢式PCR法檢測試劑盒（2G）介紹
基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴增技術(shù)，翌圣生物開發(fā)了一系列支原體快速檢測的試劑盒，包括熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒、一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒和巢式PCR法支原體檢測試劑盒。
其中，支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)對各種生物材料（如細胞培養(yǎng)物、實驗動物分泌物和動物血清等）支原體感染的檢測。該試劑盒采用定量PCR技術(shù)，針對支原體16S-23S rRNA序列保守區(qū)域設(shè)計兩套引物，進行兩輪PCR擴增，以第二輪擴增產(chǎn)物為準進行支原體污染情況判斷。其可檢出包括口腔支原體(M.orale)、肺炎支原體(M.pneumoniae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginini)、雞敗血支原體(M.gallisepticum)、關(guān)節(jié)液支原體(M.synoviae)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、檸檬螺原體(Spiroplasma citri)、唾液支原體(M.salivarium)等在內(nèi)的共34種支原體，靈敏度可達2.5 copies/μL，對于10 CFU/mL支原體標準菌株也可正常擴增有條帶，具備特異性強、靈敏度高、操作方便快速等特點，可直接用于細胞培養(yǎng)上清液的檢測。
本產(chǎn)品相較于常規(guī)PCR法支原體檢測試劑盒，可避免由于引物與模板之間的非特異配對，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；還可靈敏的檢測到樣本中微量的支原體DNA，避免假陰性的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品主要用在日常檢測用細胞或者研發(fā)早期的細胞的支原體快速檢測中。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品信息 | 支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)（貨號40614ES） | GMyc-PCR支原體檢測試劑盒（貨號40601ES） |
檢測支原體種類 | 34種，其中有9種藥典涉及到的支原體 | 12種，其中有3種藥典涉及到的支原體 |
檢測限 | 靈敏度可達2.5copies/uL | 靈敏度10copies/uL |
適用機型 | 常規(guī)PCR儀器 | 常規(guī)PCR儀器 |
應(yīng)用 | 定性檢測樣本中支原體DNA | 定性檢測樣本中支原體DNA |
產(chǎn)品特點
檢測種類多：優(yōu)化的巢式PCR技術(shù)可檢測多達34種支原體；
專屬性強：針對16S-23S rRNA設(shè)計引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣物種交叉反應(yīng)；
靈敏度高：檢測限可低至2.5 copies/μL；
操作簡便：樣本制備和檢測總時長可短至2h以內(nèi)；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽性對照(PC)無感染性，消除污染風(fēng)險。
實驗數(shù)據(jù)
檢測限
1、本試劑盒第一輪PCR擴增產(chǎn)物靈敏度為1x103 copies/μL：
2、本試劑盒第二輪PCR擴增產(chǎn)物靈敏度為2.5 copies/μL：
專屬性
1、檢測范圍：本2G版本巢式PCR支原體檢測試劑盒檢測了中外藥典要求的10CFU/mL靈敏度的共8種支原體，均可檢出。
PS：藥典要求的支原體滅活菌株DNA模板濃度為10CFU/mL，雞敗血支原體、萊氏無膽甾原體由于樣本不足未檢測
序號 | 樣本名稱（英文） | 樣本名稱（中文） | 是否檢出 |
1 | Mycoplasma fermentans | 發(fā)酵支原體 | √ |
2 | Mycoplasma citri | 檸檬螺原體 | √ |
3 | Mycoplasma hyorhinis | 豬鼻支原體 | √ |
4 | Mycoplasma pneumoniae | 肺炎支原體 | √ |
5 | Mycoplasma orale | 口腔支原體 | √ |
6 | Mycoplasma synoviae | 關(guān)節(jié)液支原體 | √ |
7 | Mycoplasma arginini | 精氨酸支原體 | √ |
8 | Mycoplasma salivarium | 唾液支原體 | √ |
9 | PC | 陽性對照 | √ |
10 | NTC | 陰性對照 | × |
2、樣本基質(zhì)干擾：選取了14種常見樣品基質(zhì)和試劑盒中的陽性對照及其加標（2.5copies/μL陽性對照）、陰性對照（PCR Mix）做驗證，14種基質(zhì)均未檢出支原體。
加樣順序 | 樣品名稱 | 加樣順序 | 樣品名稱 |
1 | MEM（1×） | 9 | RPMI medium |
2 | MCDB 131 | 10 | L-15 LEIBOVITZ MEDIA |
3 | F-12 | 11 | NUTRIENT MIXTURE-F-12 HAM'S |
4 | IMDM | 12 | RPMI Medium Modified |
5 | BME | 13 | Medium 199/EBSS |
6 | McCoy's 5A medium | 14 | DMEM/LOW GLUCOSE |
7 | DMEM | 15 | 陽性對照 |
8 | opti-MEM | 16 | NTC |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
支原體巢式PCR (2G) | 40614ESES | GMyc-PCR Mycoplasma Detection Kit (2G) 支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G) | 10 assays / 20 assays |
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