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實驗室養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴，是不是遇到過細(xì)胞養(yǎng)不好的情況？胎牛血清（FBS）作為細(xì)胞培養(yǎng)里最關(guān)鍵的一項組分，對細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用，因此我們總結(jié)了一些使用中要注意的各種tips供大家參考，記得收藏哦。

胎牛血清常規(guī)儲存在-20℃即可，但如果想長時間儲存可以保存在-80℃，盡量不要多次凍融。如果確定要溶解多次，最好按照每次用量先提前分裝，分裝后再一起凍存，用時按需解凍即可，或者直接采購小規(guī)格50 mL，使用方便快捷。

解凍時候推薦從低溫中取出后，放置于2-8℃冰箱中解凍（可過夜），使其部分溶解，然后在室溫條件下使其全部融解，溶解過程中須不時的搖動瓶身，混合里面的液體。建議采取此種方式解凍，可有效降低沉淀的產(chǎn)生。不建議直接從低溫拿到25-37℃環(huán)境中解凍，容易產(chǎn)生絮狀沉淀，并且在25-37℃環(huán)境中滯留的時間越長，越容易影響血清中一些物質(zhì)的活性，繼而影響細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)、增殖速率等。

血清中出現(xiàn)的沉淀物質(zhì)可能包括纖維蛋白（絮狀沉淀）、脂蛋白、冷凝集素、玻連蛋白、胎球蛋白、磷酸鈣與草酸鈣（顯微鏡下小黑點沉淀）及膽固醇等。

圖1  纖維蛋白形態(tài)圖

這是最常見的沉淀物之一，體積較大，可達(dá)1-2 mm，肉眼可見。纖維蛋白的形成主要是由于血清中的纖維蛋白原在解凍后凝結(jié)。纖維蛋白是形成凝血的蛋白質(zhì)之一，通常以絮狀沉淀的形式出現(xiàn)，可以通過離心的方法去除。（比如400~600 g離心5 min，取血清上清液。）

圖2 .磷酸鈣結(jié)晶形態(tài)圖

這種沉淀物會使血清渾濁，并且在37℃培養(yǎng)時會增加。磷酸鈣在顯微鏡下觀察像小黑點，有時會被誤認(rèn)為是微生物污染。

圖3 .草酸鈣結(jié)晶形態(tài)圖

草酸鈣沉淀物在血清中的形成與草酸和鈣離子的結(jié)合有關(guān)。草酸是一種有機酸，當(dāng)它與鈣離子結(jié)合時，會形成不溶于水的草酸鈣沉淀物。

如果需要去除沉淀物，可以采用離心的方法。例如，將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400-600 g離心5 min，取上清液使用。不建議過濾去除沉淀物，因為這可能會阻塞過濾膜或?qū)е聽I養(yǎng)成分流失。

產(chǎn)品沉淀的原因較多，主要有以下幾種：

(1) 溫度變化：血清在解凍過程中如果溫度變化過大(如從-20℃直接放入37℃), 容易產(chǎn)生沉淀物。

(2) 反復(fù)凍融：反復(fù)的凍融過程會導(dǎo)致沉淀物的增多。

(3) 熱滅活：熱滅活血清會顯著增加沉淀物的形成。

(4) 長時間儲存：血清在室溫或低溫冰箱中放置時間過長，不穩(wěn)定成分會被破壞，導(dǎo)致沉淀物的產(chǎn)生。

沉淀物本身不影響血清質(zhì)量，不會直接影響細(xì)胞的生長和增殖，只是沉淀如果覆蓋到細(xì)胞上面形成一層膜，可能會影響細(xì)胞對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，所以如有需要，把血清加入到培養(yǎng)基后，離心去除沉淀即可。

血清出廠前都經(jīng)過嚴(yán)格的無菌處理和質(zhì)檢，如果單從細(xì)菌這一塊考慮的話，是不需要額外過濾的，如果考慮到沉淀物，可以采取400-600 g離心5 min去除沉淀，必要時候可以加入培養(yǎng)基后，再一起過濾，盡可能減少對于營養(yǎng)物質(zhì)的損耗。

待細(xì)胞長到密度80%左右可進行細(xì)胞消化（不要等到過密再消化，此時細(xì)胞狀態(tài)可能會受影響），先用PBS潤洗細(xì)胞2-3次，同時將配置好的胰酶（一般0.25%的濃度）置于37度培養(yǎng)箱中預(yù)熱一段時間（這個對消化很有幫助），一般T25培養(yǎng)瓶中加入1 mL胰酶消化（如有需要也可以加到1.5 mL），然后將加了胰酶的培養(yǎng)瓶置于37度培養(yǎng)箱中消化，大部分細(xì)胞消化2-5分鐘左右，大約90 —120 min左右，可取出，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞是否變得松動，呈現(xiàn)圓圓的分散狀態(tài)，同時可輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)面（一定要輕柔），可讓貼壁細(xì)胞更快的脫落。若細(xì)胞還未變成圓圓的狀態(tài)，則繼續(xù)放回培養(yǎng)箱消化，若細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)變成了松散的圓形了，則加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并且800 rpm，離心3 min收集細(xì)胞。不要等到細(xì)胞全部變圓后再終止，此時可能容易消化過度，在中間可借助輕拍側(cè)壁加速消化。

首先血清培養(yǎng)加入比例一般是10%（90%培養(yǎng)基（如DMEM）+10%胎牛血清），部分細(xì)胞可能是5%或者15%進行調(diào)整，部分原代細(xì)胞可能使用20%的添加比例，具體情況可以具體實驗去摸索調(diào)整。

如果一直使用一種血清品牌，突然直接更換其他品牌，很容易出現(xiàn)細(xì)胞增殖變慢或者直接死亡的情況，哪怕是更換了性能更好品質(zhì)更高的血清，也可能會出現(xiàn)這種情況，但并不代表這款血清品質(zhì)不行，而是細(xì)胞適應(yīng)了以前的環(huán)境和代謝，你突然打破了這種平衡，它短時間適應(yīng)不了，所以必須要科學(xué)的馴化細(xì)胞去適應(yīng)新的環(huán)境，因此建議梯度替換。

建議復(fù)蘇細(xì)胞還是用原品牌血清，傳代1-2代，代細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，新血清按照25%占比（新血清：原血清=1：3）進行第一次換液，第二次換液50%占比，第三次換液75%占比，再到100%的占比逐步替換原血清，中間實時觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后再進行新的比例替換。細(xì)胞密度：保證細(xì)胞處于對數(shù)增長期，按照1:2或者1:3的傳代，維持較高的細(xì)胞密度。

鏡下培養(yǎng)中出現(xiàn)“小黑點"的原因很多，可以大致按照這幾點進行分析和排除：

1. 細(xì)菌污染：早期看到微小顆粒，后期可見移動的小黑點，并且培養(yǎng)液變得渾濁，變黃等，則懷疑是細(xì)菌污染；

2. 真菌污染：早期看到小黑點，后期可見菌絲結(jié)構(gòu)，則小黑點可能是酵母或霉菌的孢子，懷疑是真菌污染；

3. 細(xì)胞碎片：可能出現(xiàn)細(xì)胞碎片，在鏡下看起來像移動的“小黑點“，其實是細(xì)胞狀態(tài)惡化產(chǎn)生的細(xì)小碎片。碎片產(chǎn)生原因較多，有可能是細(xì)胞消化過程中用力過猛產(chǎn)生了機械損傷，也有可能是細(xì)胞過密、營養(yǎng)不足引起的細(xì)胞凋亡，還有可能是支原體污染導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不佳，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。

4. 血清沉淀：胎牛血清（FBS）中的纖維蛋白或磷酸鈣等成分解凍后形成沉淀，顯微鏡下為均勻分布的黑色顆粒。

5. 培養(yǎng)器皿/試劑污染：培養(yǎng)器皿殘留雜質(zhì)；培養(yǎng)基、胰酶等試劑中含有顆粒物。

6. “黑膠蟲"現(xiàn)象：一種非微生物污染的顆粒物，可能來源于血清、水或環(huán)境中的納米級污染物，可隨細(xì)胞移動。

1.顯微鏡觀察：

2.培養(yǎng)液狀態(tài)：

3.傳代驗證：

對于大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)而言，是不需要加熱滅活的。但在免疫學(xué)研究、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）培養(yǎng)、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)時推薦使用滅活血清。加熱血清可以使補體去活化，但同時也會破壞熱不穩(wěn)定的蛋白。熱滅活血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進作用，甚至?xí)驗闇缁畈划?dāng)，破壞血清的品質(zhì)，而抑制細(xì)胞的生長。如確實需要滅活血清，則將血清嚴(yán)格置于56℃環(huán)境中，加熱30 min進行滅活，在血清的加熱和滅活過程中需要不斷地進行搖晃混勻。