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什么是DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)。DNA甲基化的結(jié)果，一般是使甲基化位點的下游基因表達(dá)量變少。
圖1：DNA甲基化原理圖
為什么研究DNA甲基化
DNA 甲基化是早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用，比如DNA甲基化能關(guān)閉調(diào)控細(xì)胞生長基因的功能，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或過度增值；此外，DNA甲基化還能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。目前DNA甲基化已成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的研究熱點。
圖2：DNA甲基化的應(yīng)用
DNA甲基化與高通量測序
甲基化機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，使DNA甲基化的研究受到了廣泛關(guān)注，從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到動植物研究領(lǐng)域，同時在研究方法上也取得了很大突破。目前用于DNA甲基化檢測的方法大致可分成兩類：全基因組甲基化分析和特異位點甲基化檢測。以上兩類方法都是通過高通量測序來完成的，它不僅能夠覆蓋所有甲基化位點，還可以配合靶向技術(shù)檢測低頻甲基化信號，使我們能夠從全基因組水平來分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，這就是所謂的“DNA甲基化測序”。
圖3：甲基化DNA測序圖
DNA甲基化建庫
經(jīng)過甲基化修飾的DNA序列是不會改變的，常規(guī)建庫的測序不能檢測到甲基化位點，因此需要在建庫過程中對發(fā)生甲基化的位點進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分。目前全基因組重亞硫酸氫鹽測序(WGBS或BS-Seq，Whole Genome Bisulfate Sequencing)是甲基化測序的*準(zhǔn)則，市場上的甲基化建庫試劑盒也都是基于此原理研發(fā)出來的。
說到DNA甲基化建庫，我們先來看一下常規(guī)的DNA建庫流程，詳情請參考——劃重點！NGS中DNA建庫方法全面解析
主要流程：DNA //片段化——末端修復(fù)——A尾添加——接頭連接——PCR擴(kuò)增
圖4：DNA文庫構(gòu)建
與常規(guī)DNA建庫相比，甲基化建庫主要是在原有步驟的基礎(chǔ)上增加一步重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，對應(yīng)原理如下：
重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
在弱酸性條件下，亞硫酸氫根會結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的第6位，而甲基化了的C堿基不會和亞硫酸氫根發(fā)生反應(yīng)。之后，用堿處理，結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C會發(fā)生脫氨基，脫亞硫酸根，被轉(zhuǎn)化成U堿基，甲基化的胞嘧啶保持不變，還是C。
圖5：亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化原理圖
經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的DNA，再經(jīng)過PCR，PCR新合成出來的鏈，對應(yīng)U堿基的位置就會被替換成了“T”。在接下來的測序過程中，測到的也是T堿基。后，我們只需看一個位置是“C”，還是“T”，就可以區(qū)分該位點是否被甲基化 。
圖6：DNA甲基化測序?qū)?yīng)堿基
目前對應(yīng)的甲基化建庫方法主要分為以下兩類：
I：選擇甲基化處理過的特異性接頭，在文庫構(gòu)建好后用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，然后上機(jī)測序
DNA //片段化——末端修復(fù)——A尾添加——特殊接頭連接——PCR擴(kuò)增——重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化
II：DNA //片段化后直接用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，然后按照正常的DNA 建庫操作。
DNA //片段化——重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化——末端修復(fù)——A尾添加——接頭連接——PCR擴(kuò)增
兩種方法都有各自對應(yīng)的優(yōu)缺點，主要如下：
| 方法I | 方法II |
優(yōu)點 | PCR循環(huán)數(shù)較少，文庫不均一程度較低，PCR bias較少。 | 建庫的豐富程度比較高 |
缺點 | 在用亞硫酸氫鹽處理DNA文庫的時侯，90%以上的DNA鏈會斷掉。文庫的豐富度就會損失90%以上。 | 較多的PCR循環(huán)，產(chǎn)物的擴(kuò)增均一性是不太好的，PCR bias會比較大。 |
溫馨提示：
1.設(shè)置內(nèi)參：在甲基化文庫建程當(dāng)中，亞硫酸氫鹽對未甲基化的C的轉(zhuǎn)化效率并不是100%，一般是在99%左右。為了對實驗的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行質(zhì)量控制。建議在轉(zhuǎn)化實驗當(dāng)中加入內(nèi)參對照品。一般情況下，實驗當(dāng)中是加入1%的*沒有甲基化的λ DNA做內(nèi)參，主要是甲基化酶缺陷型的大腸桿菌，所生產(chǎn)出來的*沒有被甲基化的λ（噬菌體）DNA，或者pUC19（質(zhì)粒）DNA做內(nèi)參。
2.濃度測定：經(jīng)過重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA，由于其中非甲基化的“C”會轉(zhuǎn)化為“U”，所以回收后的DNA會是一種“A”,“T”和“U”占大部分的核酸分子，而且當(dāng)初的堿基配對形式也不復(fù)存在，取而代之的是主要以單鏈形式和非特異性配對形式存在的特殊核酸形態(tài)，這種形態(tài)的核酸在OD260處的吸光值與RNA更為相似，所以純化后基因組DNA的OD260值為1時，則相當(dāng)于大約40 μg/ml的核酸濃度。另外，基于處理后核酸狀態(tài)的特殊性，其OD230測值會出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，可能導(dǎo)致OD260/OD230比值不穩(wěn)定，這種情況不會影響后續(xù)的PCR反應(yīng)。
3．上機(jī)測序：為了彌補(bǔ)甲基化文庫的堿基不平衡性，一般情況下，在上機(jī)過程當(dāng)中，摻入大比例的基因組文庫，或者PhiX文庫，來補(bǔ)充比較多的C堿基，一般會摻30%的PhiX文庫、或者基因組文庫。
