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實驗試劑
氯仿[重慶川東化工集團有限公司]
異丙醇[重慶川東化工集團有限公司]
無水乙醇[重慶川東化工集團有限公司]
異戊醇[上海化學(xué)試劑有限公司]
溴酚藍[上海三愛思試劑有限公司]
二甲苯氰FF[Amersco Co.]
溴化乙錠[Amersco Co.]
飽和酚(pH 7.0 )[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
Taq DNA聚合酶[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
十二烷基肌氨酸鈉[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
十二烷基硫酸鈉[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
三輕甲基氨基甲烷[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
乙二氨四乙酸[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
飽和酚[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
100 bp Ladder DNA Marker [ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
瓊脂糖[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]
實驗設(shè)備
SW-CJ-CO凈化工作臺[蘇州凈化設(shè)備有限公司]
FA1004A型電子天平[上海精天電子儀器廠]
70型離子純水器[上海亞榮生化儀器廠]
SZ-93自動雙重純水蒸餾器[無錫科達儀器廠]
Mikro22R型高速冰凍離心機[Whatman Biometra]
5415D臺式離心機[Eppendorf]
SS-325型高壓滅菌器[Tomy Kogyo Co. Ltd]
YLE-2000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋[上海躍進醫(yī)療器械廠]
pHS-4C型酸度計[成都方舟科技開發(fā)公司]
2002型振蕩器[常州國華電器有限公司]
旋渦混合器[北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司]
梯度熱循環(huán)儀[Whatman biometra]
凝膠成像系統(tǒng)[上海四星生物技術(shù)實業(yè)有限公司]
MDF-382E型超低溫保存箱[Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd]
DYY 12型電腦三恒多用電泳儀[北京六一儀器廠]
SmartSpecTM3000核酸濃度分析儀[BIO-RAD]
實驗材料
三色書虱采自野外，在實驗室內(nèi)建立種群。
實驗步驟
1. 三色書虱總DNA的制備
(1) 將50頭書虱置于1.5mL的離心管中，用研棒在液氮環(huán)境中迅速將試蟲充分研碎后加入200μL DNA提取裂解液。
(2) 加入2.5μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2h(或培養(yǎng)過)。
(3) 用等體積的平衡酚( Tris-HC1飽和酚，pH7.8 )，溫和振蕩搖勻(約20 min )，置20℃下保存5-10 min。
(4) 4℃下離心l0min，將粘稠的水相移至潔凈的離心管中。
(5) 用等體積的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，離心(9000 r/min 10 min)取上清液。
(6) 加入0.2倍體積的乙酸鈉溶液(10 mol/L)和兩倍體積的無水乙醇，-20℃放置2h使DNA充分沉淀。
(7) 離心(12000 r/min 10 min )，棄上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗滌兩次。
(8) 沉淀晾干(盡可能除去乙醇)后，將DNA重懸浮于TE緩沖液(pH8.0 )，于37℃中輕輕搖動有利于DNA重懸浮，使DNA充分溶解。
(9) 加入Rnase至終濃度為lμg/mL，37℃保溫lhr。
(10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重懸DNA，在1μL雙蒸滅菌水或TE中，4℃保存。
(11) 取DNA4μL與2μ1 6x加樣緩沖液混勻，點樣到1.4%瓊脂糖凝膠中，以2.5-5 v/cm電泳。
(12) 0.5μg/mL的EB染色15-30min，紫外燈下觀察拍照。
制備的DNA濃度用SmartSpecTM3000核酸濃度分析儀檢測，要求先將比色杯用100μL/次的無菌水反復(fù)清洗再測水的吸光度，之后將DNA液稀釋50倍進行檢測。要求OD=1.7左右。
2. 三色書虱體內(nèi)共生細菌Wolbachia的Long PCR檢測
Long PCR的20uL的反應(yīng)體系包括:
10 x buffer | 5 μL |
25 mM MgCl2 | 2 μL |
10 mM dNTP | 0.7 μL |
Pwo酶 | 1 U |
Taq DNA | 5 U |
模板 | 10 ng |
10μM引物 | 1.6 μL |
wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A
wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC
用無菌水將反應(yīng)體系補充至20μL
擴增條件為：94 ℃ 2min預(yù)變性后，94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin，10個循環(huán)；94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin。25個循環(huán)，每個循環(huán)在68℃下延長20sec。
擴增結(jié)束后取5μL的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(電壓5v/cm，電泳緩沖液為1 X TAE )，Bio-Rad凝膠成象系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
3. 序列的測定和分析
Wolbachia wsp基因序列由Long PCR產(chǎn)物上海生工直接測序獲得。DNA序列檢索和同源性比較利用BLAST工具(NCBI)。用程序中的zui大似然法(Maximum Likelihood method，ML)重建系統(tǒng)發(fā)生樹，系統(tǒng)發(fā)生樹中結(jié)點的自舉檢驗置信度以1000次重復(fù)計算估計。對獲得的三色書虱體內(nèi)Wolbachia的wsp基因的片段進行系統(tǒng)發(fā)育分析，其它一些宿主體內(nèi)的Wolbachia的wsp基因的片段則通過GenBank獲得。
