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微生物學(xué)技術(shù):PCR法檢測支原體

2014-8-14  閱讀(1387)

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PCR法是20世紀80年代中期建立起來的一種體外DNA擴增技術(shù),其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng),即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下,經(jīng)DNA聚合酶的作用,使DNA 鏈擴增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點,但其對實驗環(huán)境的要求嚴格,實驗成本較高,有時還有假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。

1、儀器設(shè)備

超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機、旋渦混懸器等。

2、實驗試劑

選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒(內(nèi)有引物、陽性對照、內(nèi)對照、StrataClean resin、緩沖液),dNTP,TapDNA聚合酶,緩沖液,瓊脂糖,礦物油。

3、實驗操作

PCR反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進行。

(1)樣品的收集:待測細胞用抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d,用無菌容器取上清液500ul,4℃保存待測。

(2)模板的制作:在無菌的條件下,取細胞培養(yǎng)上清100ul于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi),蓋好蓋子,95℃水浴加熱5min。

(3)打開蓋子,向管內(nèi)加StrataClean resin10ul,蓋好蓋子,旋渦混懸器混合,離心5—10s,吸取上清至一新的塑料離心管中,模板制作完畢,4℃保存。

(4)PCR反應(yīng):反應(yīng)體系zui適條件為:10mmol/lTris-HCL(pH8.38);50mmol/lHCL;1.5-2.5mmol/lMgCL2;200umol/ldNTP;2UDapDNA聚合酶。總反應(yīng)體系為50ul,反應(yīng)用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應(yīng)如下表:

 表 反應(yīng)程序

      程   序   循   環(huán)溫度/℃       時間/min
  942
11502
  722
  941
240501
  722


①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應(yīng)緩沖液。

②依次加入下列成分:0.4uldNTPs(25mmol/l),0.4ulTaqDNA聚合酶(5U/ul),2ul引物。

③加2ul去離子水,總體積45ul。

④加2ul已制成的模板到反應(yīng)體系中。

⑤陽性對照,內(nèi)對照各5ul加入到各自的反應(yīng)體系中。

⑥取一支含有以上反應(yīng)體系的離心管,加入5ul去離子水作為陰性對照管。

⑦在反應(yīng)體系中加入100ul礦物油。

(5)瓊脂糖凝膠電泳:PCR反應(yīng)結(jié)束后,進行瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結(jié)束后,凝膠成像分析結(jié)果。

(6)結(jié)果分析:該方法為檢測支原體的定性方法,在電泳泳道上,MARKER、陽性對照、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶,當被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶,且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間,即可認為該樣品被支原體污染。有時還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條,可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn),則可懷疑有支原體污染,重做該樣品。

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