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細胞技術(shù)專題:軟瓊脂克隆形成實驗

2014-3-12  閱讀(2399)

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原理:

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù),但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞??寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學(xué)性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱,傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱,轉(zhuǎn)化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱,腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系,做克隆形成率測定時,接種細胞一定要分散成單細胞懸液,直接接種在碟皿中,持續(xù)一周,隨時檢查,到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

基本步驟:

(1)取對數(shù)生長期細胞,用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,使之成為單細胞,作活細胞計數(shù),用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液,高壓滅菌后,維持在40℃中不會凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷卻凝固,可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后,再向管中加入0.2mL的細胞懸液,充分混勻,注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中,逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后,置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細胞克隆數(shù)。計算形成率。

軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時,瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個,一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖,不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。

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