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細(xì)胞技術(shù)專題:大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2014-2-20  閱讀(1114)

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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)方法原理水合氯醛腹腔麻醉,采用膠原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度離心的方法分離、純化大鼠胰島,并分離、培養(yǎng)胰島單細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)材料

一周齡Wistar 大鼠

試劑、試劑盒

D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型膠原酶 葡萄糖 碘乙酸

儀器、耗材

手術(shù)剪 手術(shù)鉗 眼科剪刀 眼科鑷子 大頭針 手術(shù)刀片 培養(yǎng)皿

實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)步驟


1. 一周齡Wistar大鼠,斷頸處死,于75%乙醇浸泡15 分鐘,無菌取出胰腺,于冰冷無菌D-Hanks’液中漂洗,用眼科剪仔細(xì)清除脂肪、包膜、血管等胰外組織,轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中。

 

2. 加入少量無菌D-Hanks’液,用眼科剪剪成0.1-1.0 mm大小的碎片,用滴管輕輕吸出上層細(xì)小脂肪碎塊和油滴,再用無菌D-Hanks’液反復(fù)清洗 8~10 次,加入10 倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液:0.05  g 胰蛋白酶,0.025 g Ⅴ型膠原酶(663 U/mg),0.05 g 葡萄糖,溶于100mL 無Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值為 7.4)溶液,用0.22 µm 微孔濾膜濾菌],38℃±1℃消化,消化過程中不斷震蕩,10 分鐘后棄去上清液。

 

3. 用無菌D-Hanks’液將組織塊清洗 2~3 次,加入新鮮酶液繼續(xù)消化,重復(fù)上述步驟,此時(shí)組織塊邊緣模糊。

 

4. 將組織塊浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10 分鐘,將消化酶液與組織塊分開,組織塊重新加入新鮮消化酶液進(jìn)行消化;而原消化酶液1500  rpm離心 10 分鐘,取沉淀即為消化下的細(xì)胞,重新用無菌D-Hanks’懸浮,離心,重復(fù) 1~2 次,再用培養(yǎng)基洗 2~3 次,用培養(yǎng)基懸浮即得細(xì)胞懸液。

 

5. 將消化過的組織塊重復(fù)消化5~6 次至組織塊消化*,重復(fù)以上操作。

 

6. 合并幾次所得細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105個(gè)細(xì)胞/mL,將細(xì)胞懸液接種于24 孔塑料培養(yǎng)板中,每孔1 mL,置于37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

7. 由于成纖維細(xì)胞貼壁要比胰島細(xì)胞迅速,接種15 h 后,輕輕振蕩培養(yǎng)板,將上面未貼壁的細(xì)胞接入新的培養(yǎng)板中,可除去部分成纖維細(xì)胞。

 

8. 將新培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時(shí)后,換新鮮配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h,可除去絕大部分成纖維細(xì)胞,而胰島細(xì)胞不受傷害,換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2 次,并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在 37℃、5% CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔 3 天換培養(yǎng)液,獲得單層胰島細(xì)胞。

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