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細胞技術專題:小鼠肝細胞原代培養(yǎng)實驗

2014-2-20  閱讀(1072)

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標簽: 小鼠 肝細胞 原代培養(yǎng)

小鼠肝細胞原代培養(yǎng)可以:(1)用于細胞保種;(2)用于分子生物學研究;(3)用于基因治療研究。

實驗方法

  • 胰酶消化法
實驗方法原理將小鼠的肝細胞從機體中取出,經胰酶、螯合劑(常用EDTA)處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖。
實驗材料

小鼠

試劑、試劑盒

DMEM 無血清DMEM培養(yǎng)基 胰酶 PBS

儀器、耗材

飯盒 紗布 剪子 鑷子 燒杯 平皿 研磨玻片 濾網 離心管 6孔培養(yǎng)板 吸管 移液管 手套 微量加樣器

實驗步驟

一、實驗材料準備
 

1.  動物:小鼠。
 

2.  試劑:DMEM(含血清)、無血清DMEM培養(yǎng)基、胰酶、PBS。
 

3.   器械:飯盒、紗布、小剪子、小鑷子、大鑷子、大燒杯、平皿、研磨玻片、濾網、離心管(15/50 ml)、6孔培養(yǎng)板、吸管、移液管、手套、微量加樣器。
 

4.  準備:酒精擦拭臺面后把物品擺放好,開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結束。
 

二、方法
 

1.   將小鼠斷頸致死,置75%酒精泡2-3秒鐘,取肝臟,置于盛有PBS的平皿中。
 

2.   剔除脂肪、結締組織、血液等雜物,轉移到另一個盛有PBS液的平皿中。
 

2.3 用手術剪將臟器剪成小塊(大小約1mm2),玻片研磨,轉到離心管,離心(1 000 rpm,5 min)。
 

4.  視組織或細胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶,37℃中消化20分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
 

5.   加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。
 

6.   用100目孔徑濾網濾過,除去未消化的大組織塊。
 

7.   再次離心5 min,棄上清液。
 

8.   加入無血清培養(yǎng)液5 ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
 

9.  加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml(視細胞量),血球計數(shù)板計數(shù)。
 

10.   將細胞調整到5×105/ml左右,轉移至6孔培養(yǎng)板中,37℃下培養(yǎng)

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