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細(xì)胞技術(shù)專題:細(xì)胞自噬的研究方法

2014-2-13  閱讀(2042)

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正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低,不適于觀察,因此,必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié),經(jīng)報(bào)道的工具藥有:

 

一、自噬誘導(dǎo)劑
 

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

(2) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase 抑制劑(即Inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶)

(3) Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin:mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑

 

二、自噬抑制劑
 

(1) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1:質(zhì)子泵抑制劑

(3) Hydroxychloroquine(羥氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)

 

除了選用上述工具藥外,一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù):包括反義RNA干擾技術(shù)(Knockdown)、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>


三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后,需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測,常用的策略和技術(shù)有:

 

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),普通光鏡下看不到,因此,直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀,雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1)的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分,如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2)的特征為:單層膜,胞漿成分已降解。(autophagic vacuole,AV)

 

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時(shí)長,不利于監(jiān)測(Monitoring)自噬形成,人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí),GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí),GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn),一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體,可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

 

3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成

自噬形成時(shí),胞漿型LC3(即LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。

(注意:LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力,會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用,同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

 

4、檢測長壽蛋白的批量降解:非特異

 

5、MDC(Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體,所有酸性液泡都被染色,故屬于非特異性的。

 

6、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,故也屬于非特異性的。

 

四、自噬相關(guān)蛋白的定位

在研究自噬相關(guān)蛋白時(shí),需對(duì)其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切,為了區(qū)別,常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位:

 

Lamp-2:溶酶體膜蛋白,可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM 探針:有紅或藍(lán)色可選,顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito:載體,轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個(gè)融合蛋白(紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號(hào)),可用來檢測線粒體被自噬掉的程度(Mitophagy)。

MitoTraker探針:特異性顯示活的線粒體,熒光在經(jīng)過固定后還能保留。

Hsp60:定位與線粒體基質(zhì),細(xì)胞死亡時(shí)不會(huì)被釋放。

Calreticulin(鈣網(wǎng)織蛋白):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔

 

(注意:這些蛋白均為胞漿蛋白,爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜(permeablize),可采用0.1%SDS處理。)

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