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蛋白質(zhì)技術專題:細胞凋亡的幾種檢測方法

2014-1-7  閱讀(1875)

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一、形態(tài)學觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察:凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團塊狀,細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。

2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:活細胞核 呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色:如果細胞膜 不完整、破裂,臺盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為臺盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實,細胞器 集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

二、DNA凝膠電泳

(一)、檢測原理

細胞發(fā)生凋亡或壞死,其細胞DNA均發(fā)生斷裂,細胞內(nèi)小分子量DNA斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA斷,而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細胞的死亡,并可與壞死細胞區(qū)別。

(二)結果判斷

正?;罴毎鸇NA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。

三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定

凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA斷組成,可由ELISA法檢測。

(一)檢測步驟

1、將凋亡細胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體;

2、在微定量板上吸附組蛋白體’

3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘

4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合’

4、加酶的底物,測光吸收制。

(二)用途

該法敏感性高,可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。

四、流式細胞儀定量分析

(一)檢測原理

細胞發(fā)生凋亡時,其細胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點,被檢測細胞懸液用熒光素染色,利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

(二)應用價值

流式細胞儀檢測具有以下特點:

1)、檢測的細胞數(shù)量大,因此其反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確

2)、可以做許多相關性分析

3)、結合被檢測細胞的DNA含量的分析,可確定凋亡的細胞所處的細胞周期

■檢測形態(tài)學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法

細胞發(fā)生凋亡時,其細胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間,利用這一特點,被檢測細胞懸液用熒光素染色,利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。

利用Hoechs-PI染色法,正常細胞對染料有抗拒性,熒光染色很淺,凋亡細胞主要攝取Hoecha染料,呈現(xiàn)強藍色熒光,而壞死細胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強的紅色熒光。

■DNA斷原位標記法

凋亡細胞DNA斷原位末端檢測技術是指在細胞(或組織)結構保持不變的情況下,用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)相反應與凋亡細胞裂解后3·的羥基(-OH)端結合,經(jīng)顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。

DNA段原位標記法有二種:

1、原位缺口轉移(in situ nick-translation,ISNT)技術,它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·-OH端

2、原位缺口末端標記技術(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT將標記的DUPT接到3·-OH端。研究證明,TUNEL法的敏感性遠高于ISNT,尤其對早期凋亡的檢測,TUNEL更為合適。

■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法

1、原理:在細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V(Annexin V)是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白,它于PS具有高度的結合力。因此,Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V,將Annexin V標記上熒光素(如異硫氰酸熒光素FITC),同時結合使用PI拒染法(因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測,且對PI高染)進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

2、結果判斷:正?;罴毎?font style="">Annexin V 、PI均低染;凋亡細胞Annexin V高染、PI低染;壞死細胞Annexin V/PI均高染。

3、應用價值:細胞發(fā)生凋亡時,膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生,因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞,可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA段丟失。因此,Annexin V聯(lián)合PI法更加省時,結果更為可靠,是目前zui為理想的檢測細胞凋亡的方法。

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