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蛋白質(zhì)技術(shù)專題:蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

2013-12-3  閱讀(1183)

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[原理]

蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉(SDS)和巰基乙醇的作用下,分子中的二硫鍵還原,氫鍵等打開,形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物,該復(fù)合物帶負(fù)電,故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移,且主要由于凝膠的分子篩作用,遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān),因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。

聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng),主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠,配制凝膠的緩沖液,其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同,故電泳時(shí),樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng),在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面,大大濃縮了樣品的體積,即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。

[試劑]

1、30%凝膠貯備液:稱取29g 丙烯酰胺(Acr)和1g 甲叉-雙丙烯酰胺(Bis),加蒸餾水至100ml,濾紙過濾貯存。

2、10% SDS:稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。

3、10%過硫酸胺(AP)

4、N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)

5、5×電泳緩沖液:于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris、94g甘氨酸、5g SDS,混勻后加蒸餾水至1 000ml。

6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)

7、電泳加樣緩沖液

10mmol/LpH6.8 Tris

200mmol/LDTT

4%SDS

0.2% 溴酚蘭

20% 甘油

8.正丁醇

[器材]

1、移液器

2、移液管

3、燒杯

4、垂直電泳槽

5、電泳儀

[操作步驟]

1.配制分離膠濃度8%、體積15ml

H2O 6.9ml

30%凝膠貯備液 4.0ml

1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml

10%SDS 0.15ml

10%過硫酸胺 0.15ml

TEMED 0.01ml

2.一旦加入TEMED,混勻后立即小心地將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中,為成層膠留有足夠空間。用毛細(xì)管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇,以阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。

3.聚合完成之后,倒掉覆蓋液體,用去離子水洗凝膠上部數(shù)次,盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體。

4.配制5%成層膠5ml,插入梳子,小心避免混入氣泡,垂直放置室溫下。

H2O 3.4ml

30%凝膠貯備液 0.83ml

1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml

10%SDS 0.05ml

10%過硫酸胺 0.05ml

TEMED 0.01ml

5.在成層膠聚合時(shí),將樣品與加樣緩沖液混勻,100℃加熱3min。

6.成層膠聚合完成后,用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺,將凝膠放入電泳槽上。

7.加樣

8.電泳:開始時(shí)電壓為8V/cm凝膠,染料進(jìn)入分離膠后,將電壓增加到15V/cm凝膠,繼續(xù)電泳直到染料抵達(dá)分離膠底部,斷開電源。

9.取下凝膠,固定、染色或進(jìn)行Western blot分析。

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