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農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)
農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備可以：（1）用于建立農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于農(nóng)桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；（3）用于農(nóng)桿菌其他分子生物學(xué)研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 氯化鈣法
- 電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70℃可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株 |
| 試劑、試劑盒 | YEB液體培養(yǎng)基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸鎂 氯化鈣 利福平儲(chǔ)液 |
| 儀器、耗材 | 超凈工作臺(tái) 恒溫?fù)u床 冷凍高速離心機(jī) 高壓滅菌鍋 冰箱 超低溫冰柜 分光光度計(jì) 接種針 試管 離心管 離心管 冰浴 微量進(jìn)樣器 吸頭 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 1. 儀器 超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，冷凍高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計(jì)，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。 以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。 2. 材料 土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株 3. 試劑 （1）YEB液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。 （2）利福平（Rif）儲(chǔ)液：50 mg/ml （3）20 mM CaCl2，高壓滅菌。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養(yǎng)過。 2. 取過培養(yǎng)菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5。 3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。 4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30 min。 5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預(yù)冷的20 mM CaCl2，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24 hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/div> |
