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在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。
實(shí)驗(yàn)方法
- 制備DNA
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 動(dòng)物組織 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | PBS 乙酸銨 乙醇 酚 氯仿 異戊醇 TE |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) 搖床 研缽 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 1. 切下組織并立即剪成小塊，置于液氮中凍結(jié)。 2. 將200 mg~1 g 的組織用預(yù)冷的研缽和研杵研碎，或用錘子將其搗為細(xì)粉末，每100 mg 組織用1. 2 ml 消化緩沖液懸浮。 3. 500 g 離心細(xì)胞5 min，棄上請(qǐng)。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞先用胰酶消化。 4. 細(xì)胞用1~10 ml 冰冷的PBS重懸，500 g 離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。 5. 用1體積 的消化緩沖液重懸細(xì)胞。 6. 將樣品在蓋緊的管中于50℃搖蕩下溫育12~18 h。 7. 用等體積的酚/氯仿/異戊酵抽提樣品，1 700 g 離心10 min。 8. 如果樣品溶解得不好， 再加1體積不含蛋白酹K的消化緩沖液，并重復(fù)離心。 9 如果在界面上有一層厚的白色物質(zhì)，重復(fù)有機(jī)抽提，將上層（水溶液）轉(zhuǎn)移至一個(gè)新管中。 10. 加入1/2體積7.5 ml 乙酸銨和2體積100%乙醉，1 700 g 離心2 min。 11. 用70%乙酵洗滌，晾干，沉淀用TE。 12. 緩沖液重新溶解，使終濃度在約1 mg/ml 左右 |
