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三、操作步驟
（一）取材、冰凍切片：
將動(dòng)物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動(dòng)物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見(jiàn)圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交玻片上，切片厚度為15-20μm。
（二）探針制備與檢測(cè)（定量）：
1. 隨機(jī)引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標(biāo)記檢測(cè)試劑盒為例：
（1）探針制備：
①模板DNA（0.5-3 μg） 15 μl，100℃變性10 min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反應(yīng)總體積為20 μl。37℃孵育過(guò)。
③在上述20 μl 的標(biāo)記產(chǎn)物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（無(wú)水乙醇預(yù)冷，輕輕混勻，-20℃放置 2 hr。4℃離心12 000 g×15 min，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷） 50 μl 洗滌，7 500 g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
（2）探針敏感性檢測(cè)：
①樣品稀釋：取dig-標(biāo)記探針1 μl 用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀釋。
②取一張與點(diǎn)樣器大小相近的尼龍膜，標(biāo)記方向，ddH2O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置點(diǎn)樣器上，負(fù)壓抽吸5 min。
③將上述樣品點(diǎn)于尼龍膜上，繼續(xù)抽吸10 min。
④取下尼龍膜，置紫外燈下10 cm 處照射5 min，晾干。
⑤將膜置于適量預(yù)雜交液（5-10 ml）中，37℃預(yù)雜交10 min。
⑥加入Anti-dig 抗體（1：5000），37℃雜交30 min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。
⑧顯色：15 ml TSM2中加300 μl 顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30 min。
2. PCR法制備cDNA核酸探針：
（1） 探針制備：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：
在0.5 ml 離心管中，依次加入：
PCR引物 1（10 pM） 2 μl；
PCR引物 1（10 pM） 2 μl；
質(zhì)粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；
PCR DIG mix 2 μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）；
dNTPmix 2 μl；
10×PCR buffer 5 μl；
Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；
加入適量ddH2O，使總體積達(dá)50 μl。
① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。
一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7 min。
② 在上述PCR產(chǎn)物中加入4 M LiCl 12.5 μl、預(yù)冷無(wú)水乙醇375 μl，輕輕混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，棄上清。70%乙醇（預(yù)冷） 120 μl 洗滌沉淀，離心7500g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
（2）探針檢測(cè)：
行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測(cè)法）。
（三）原位雜交反應(yīng)（以DIG-cDNA探針為例）：
1. 0.1 M PBS （pH 7.2） 浸 5-10 min。
2. 0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。
3. 0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。
4. 0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃孵育30 min。
5. 4%多聚甲醛浸5 min。
6. 0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。
7. 預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液，42℃ 30 min。
（1）雜交：傾去預(yù)雜交液，在每張切片上滴加10-20 μl 雜交液（將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2℃ 過(guò)。
（2）洗片：
4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；
0.2×SSC 37℃洗10 min；0.2×SSC與0.1 M PBS各半洗10 min；
0.05 M PBS 洗 5 min×2次。
10. 3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。
11. 滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過(guò)。
12. 0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鮮配制TSM2 10 min×2次。
13. 顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過(guò)。
14. 將玻片置于TE中10-30 min以終止反應(yīng)。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹(shù)膠封片。
15. 顯微鏡下觀察結(jié)果。
四、注意事項(xiàng)：
1. 作為DNA-RNA的雜交，需防RNase的污染。
2. cDNA探針在雜交時(shí)必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5 min，冰浴驟冷
