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- 氯化鈣法
- 電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70℃可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)，質(zhì)粒載體系統(tǒng)中zui常用的質(zhì)粒有：Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒。
發(fā)表于2005-10-10 10:36
snokey: 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)： 1. 感受態(tài)盡量新，而且不要太濃（0.3-0.5）； 2. CaCl2盡量新； 3. 涂板只加Kan 50mg/L，等出了菌落再加到100mg/L； 4. pBI121本身拷貝數(shù)低，轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)的就慢些； 5. LB營(yíng)養(yǎng)沒(méi)有YEP豐富，其實(shí)關(guān)系不大； 6. 4404不好用，能用105就不要用4404，105轉(zhuǎn)化效率通常比4404好的多 。
發(fā)表于2006-08-01 23:17
seesky: 農(nóng)桿菌質(zhì)粒提取和酶切問(wèn)題
從農(nóng)桿菌中可以抽出質(zhì)粒，但做不了酶切試驗(yàn)，原因是： 1. 量太少，主要是菌裂解困難，以及農(nóng)桿菌雙元載體攜帶的是低拷貝復(fù)制子； 2. 雜質(zhì)太多，酶切后呈現(xiàn)smear帶，無(wú)法判斷是否有目標(biāo)基因。
