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技術(shù)文章

BCA 蛋白定量檢測試劑盒測蛋白濃度步驟

閱讀:667          發(fā)布時(shí)間:2024-9-19

     取適量未變性的總蛋白溶液,用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒(G2026-200T;G2026-1000T)測蛋白濃度,蛋白樣品在進(jìn)行SDS-PAGE電泳等實(shí)驗(yàn)研究之前要進(jìn)行精確的定量,以保證同一實(shí)驗(yàn)中不同樣品之間上樣量的一致性以及結(jié)果可比性。因此,蛋白濃度測定是研究蛋白中常用、最基本的分析技術(shù)之一。

    BCA原理:在堿性條件下,蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)能與Cu2+結(jié)合生成絡(luò)合物,同時(shí)將Cu2+還原為Cu+。BCA試劑可靈敏特異的與Cu+結(jié)合,形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物,562nm處有最高的吸收值,可在562nm測定其吸收值,顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比,即可計(jì)算待測蛋白的濃度。


蛋白濃度測定方法如下:
1.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液
取1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)蛋白標(biāo)準(zhǔn)管中,將25 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全溶解,即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液。配制成的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液可-20℃長期保存。

2.配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液
取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用PBS或生理鹽水稀釋50倍,得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液。注意稀釋時(shí)按照10倍梯度方法稀釋,確保稀釋準(zhǔn)確。

3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(酶標(biāo)儀法)
將蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中,然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補(bǔ)足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

4.準(zhǔn)備待測樣品
將待測的蛋白樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋(可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測,使樣品蛋白濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),確保檢測結(jié)果可信),按照每個(gè)樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用相同溶液稀釋。

5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻,得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存,24 h內(nèi)使用。每個(gè)待測樣品需200 μL,建議按需配制,避免浪費(fèi)。

6.檢測
向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL,充分混勻(可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s),37℃反應(yīng)30 min后,以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)做參比,在562 nm波長下比色測定,記錄各孔吸光度值。(注:也可以在室溫反應(yīng)2 h,或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低,建議置于60℃反應(yīng))

7.計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)曲線中梯度蛋白含量(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度(μg/mL),再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實(shí)際蛋白濃度。

提示:
1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時(shí)間的影響較大,吸光度值會(huì)隨著時(shí)間的延長或溫度升高而變化,如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度,建議每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 在進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制時(shí),需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)建議10倍梯度稀釋,不要一次稀釋50倍,以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量,樣品的提取和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液,同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值,建議使用其他的方法測定。

4. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服,并佩戴一次性手套。

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