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細胞凍存實驗重點干貨分享
閱讀：340 發(fā)布時間：2024-5-27細胞凍存是指將細胞放在低溫環(huán)境，以達到減少細胞代謝的作用，從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的，以供后續(xù)實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則，慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因為產(chǎn)生大的冰晶而收到損害。
一、原理
當溫度低至-70℃時，細胞內(nèi)的代謝活動及酶活性幾乎全部停止，低于-130℃時，細胞能達到最佳存活率。液氮可實現(xiàn)細胞的長期保存。
冷凍保護劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內(nèi)離子濃度，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而達到保護細胞的目的。
二、貼壁細胞凍存操作步驟
1、預(yù)熱凍存液；
2、用PBS沖洗細胞，加入胰酶消化（此步驟同細胞傳代操作）；
3、終止消化后，重懸細胞，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm離心5min；
4、棄上清，加入預(yù)熱的細胞凍存液，細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；
5、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；
6、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；
7、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。
三、懸浮細胞凍存操作步驟
1、用移液管將細胞懸液吹吸均勻，將細胞懸液移入離心管；
2、1000rpm離心 3 min，收集細胞沉淀；
3、用預(yù)熱的凍存液重懸細胞，細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；
4、分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；
5、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；
6、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。
貼壁細胞凍存操作示意圖
注意事項：
① 細胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作。
② 傳代時需要適度的消化，消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
③ 傳代應(yīng)在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行。
④ 細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中。
⑤ 應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，并且活力達90%以上處于對數(shù)生長期時的細胞進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整。
⑥ 程序凍存盒、細胞凍存液、全培養(yǎng)基等試劑都要復(fù)溫至室溫備用。
⑦ 凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長，以免造成細胞損傷。
⑧ 凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時水會滲入造成污染。
⑨ 細胞不可長期保存在-80℃冰箱中，放置時間不要超過3天。
⑩ 液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。